近日，由廣東省人民醫(yī)院急診科李欣教授團(tuán)隊牽頭中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院內(nèi)分泌科劉丹教授團(tuán)隊、中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心陳思凡研究員團(tuán)隊、林芝市人民醫(yī)院王玉娥主任團(tuán)隊、上海百趣代謝組學(xué)技術(shù)研究中心劉志鵬研究員團(tuán)隊在Science of The Total Environmental上發(fā)表了題為“Moderate altitude exposure impacts host fasting blood glucose and serum metabolome by regulation of the intestinal flora”的論文。研究表明，中等海拔暴露會影響人體腸道微生物群和血清代謝組，可能為胰島素抵抗相關(guān)的代謝綜合征等疾病的預(yù)防或治療開辟新的途徑。
 

廣東省醫(yī)療援藏首席專家、廣東省人民醫(yī)院李欣教授，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心陳思凡研究員和上海百趣代謝組學(xué)技術(shù)研究中心劉志鵬研究員為共同通訊作者；廣東第三批援藏隊員、中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院劉丹教授，廣東省人民醫(yī)院高小燕博士，廣東省人民醫(yī)院黃筱然博士及上海百趣代謝組學(xué)技術(shù)研究中心范艷群助理研究員為論文共同第一作者。

圖1 研究內(nèi)容要點

圖2 臨床指標(biāo)和宏基因組結(jié)果

2.2 中等海拔暴露對腸道菌群的影響
為進(jìn)一步研究中等海拔暴露對特定腸道微生物和代謝途徑的影響，我們對來自Cohort B的83份糞便樣本進(jìn)行宏基因組測序，發(fā)現(xiàn)中等海拔暴露12個月（12M組）的腸道微生態(tài)群落豐富度降低、α多樣性升高。主坐標(biāo)分析(Principal Co-ordinates Analysis，PCoA)表明志愿者入藏前后腸道微生態(tài)（如門、屬和種水平）出現(xiàn)顯著變化。入藏12個月后，Firmicutes/Bacteroidetes顯著降低（圖2 D），Bacteroidetes增加，Proteobacteria減少（圖2 E）。在種水平上，12M組20個菌增加，24個菌減少；其中，Bacteroidetes ovatus在12M組中顯著增加，Actinomyces odontolyticus和candidate division_TM7_single_cell_isolate_TM7b等在12M組中顯著減少。擬桿菌屬中的B. ovatus、Bacteroides thetaiotaomicron (B. thetaiotaomicron), Bacteroides uniformis (B. uniformis)和副擬桿菌屬的Parabacteroides distasonis (P. distasonis)在12M組中增加（圖2 E），這些菌被報道可減輕HFD喂養(yǎng)小鼠的代謝綜合征。此外，也發(fā)現(xiàn)E. coli、Rothia mucilaginosa和A. odontolyticus等有害菌在12M組中減少。

為初步探究高海拔暴露時間和民族因素對腸道菌群的影響，對常駐林芝的漢族（Local_H）和藏族（Local_T）的菌群進(jìn)行分析，與入藏前漢族0M相比，Local_H組和 Local_T組的群落豐富度較低，但α多樣性沒有差異；且無論居住多長時間，Local_T組在門、屬和種水平上的β多樣性顯著低于漢族人群。Firmicutes/Bacteroidetes在漢族（12M組）、Local_H組和Local_T組間沒有差異（圖2 D），Bacteroidetes和Bacteroides在藏族人群中的含量比漢族人群高。由于樣本數(shù)量受限，高海拔暴露時間和民族因素對腸道菌群的影響還有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

2.3 中等海拔暴露對腸道菌群功能的影響
對鑒定出的6435個KOs進(jìn)行差異分析，與入藏前相比，入藏后12個月的腸道菌群的318個KOs增強(qiáng)，537個KOs減弱；40個KEGG module增強(qiáng)和55個KEGG module減弱，31條KEGG pathway增強(qiáng)和25條KEGG pathway減弱。其中，與L-Glutamate相關(guān)的氨基酸代謝通路（如D-glutamine and D-glutamate metabolism、Alanine, aspartate and glutamate metabolism、GABAergic synapse、Glutamatergic synapse、 和Arginine and proline metabolism）在12M組中顯著升高，表明腸道菌群的L-Glutamate代謝可能在中等海拔暴露個體中發(fā)揮重要作用。此外，與BCAAs降解相關(guān)的KEGG module如‘Leucine degradation, leucine=>acetoacetate+acetyl-CoA’、‘Pantothenate biosynthesis, valine/L-aspartate => pantothenate’在12M組中顯著增強(qiáng)，表明中等海拔暴露個體的腸道菌群可能有更高的BCAAs降解能力。

為進(jìn)一步了解腸道菌群的厭氧發(fā)酵能力，通過基因注釋獲得GMMs (Gut Metabolic Modules)，與入藏前相比，入藏后12個月的腸道菌群的14個MFs增強(qiáng)，11個MFs減弱，其中參與丙酸合成代謝的MF0084(Succinate conversion to propionate)、MF0093(Propionate production I)、MF0094(Propionate production II)和MF0080(Lactate consumption II)在12M組中減弱，據(jù)報道丙酸的增加與T2DM風(fēng)險增加相關(guān)，上述表明入藏后腸道菌群的丙酸合成能力降低。該推測通過對兩個隊列的血清丙酸進(jìn)行靶向檢測得到驗證，且12M組的丙酸含量開始與林芝地區(qū)居住5年以上的個體變得相近（圖3 A、B）。

最后，使用HUMAnN 2分析中等海拔暴露相關(guān)的微生物對MetaCyc通路的貢獻(xiàn)度，與入藏前相比，41條PWY通路在12M組中升高（如厭氧功能gondoate合成通路PWY-7663中B. ovatus和B. thetaiotaomicron貢獻(xiàn)度較高），92條PWY通路降低（如LPS生物合成通路LPSSYN-PWY、芳香族氨基酸合成通路(PWY-6628、PWY-6629、PWY-6630)中E. coli貢獻(xiàn)度較高等）（圖3 C）。與腸道菌群組成的變化類似，NMDS分析表明中等海拔暴露個體的微生物組功能與居住在林芝五年以上的個體的腸道菌群功能相似。
 

圖3 入藏前后腸道菌群功能的變化

2.4 中等海拔暴露對血清代謝物的影響
有研究報道T2D和肥胖患者的血清代謝物變化與腸道菌群的改變有關(guān)。對306個血清樣本進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)檢測，與入藏前相比，正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis, OPLS-DA)發(fā)現(xiàn)入藏后血清代謝輪廓出現(xiàn)了顯著變化，兩個隊列的血清基線具有相似的代謝譜（圖4 A）。對Cohort A的血清代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行線性混合模型分析（Linear Mixed Effect，LME）分析，發(fā)現(xiàn)112個與中等海拔暴露相關(guān)的代謝物�；�于時間序列分析(Short Time-series Expression Miner analysis，STEM)發(fā)現(xiàn)32個代謝物（如L-谷氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸和γ-谷氨酰纈氨酸等）隨中等海拔暴露時間增長而降低，15個代謝物（如L-谷氨酰胺）隨中等海拔暴露時間增長而增加（圖4 B）。代謝通路富集分析表明D-glutamine and D-glutamate metabolism和Alanine, aspartate and glutamate metabolism發(fā)生顯著變化（圖4 C）。

非靶向血清代謝組學(xué)和宏基因組學(xué)都表明AAs的變化可能與腸道菌群功能改變有密切關(guān)系，對423份血清樣本進(jìn)行了AAs定量檢測。OPLS-DA分析顯示，兩個隊列中的AAs譜發(fā)生顯著變化（圖4 D），且AAs隨著中等海拔暴露時間的增加而顯著變化。Cohort A和Cohort B中漢族人的18個未修飾AAs、與胰島素抵抗相關(guān)的AAs（BCAAs和AAAs的總和）的濃度在中等海拔暴露后顯著降低（圖4 E）。24個檢測的AAs中，與入藏前相比，入藏后12個月的血清中19個AAs減少，3個AAs增加（圖4 F），其中L-谷氨酸和L-纈氨酸顯著降低，而L-谷氨酰胺的弱顯著性增加。此外，中等海拔暴露個體的AAs譜與常駐林芝五年以上個體的血清AAs譜變得相似（圖4 D）。
 

圖4 入藏前后血清非靶代謝組和氨基酸檢測結(jié)果

2.5 與腸道菌群相關(guān)的代謝物與表型的關(guān)聯(lián)
為進(jìn)一步確定中等海拔暴露相關(guān)的血清AAs和腸道微生物組之間的相關(guān)性，進(jìn)行了spearman相關(guān)性分析。L-谷氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸與Bacteroidetes負(fù)相關(guān)，與Proteobacteria正相關(guān)（圖5 A）；種水平上，L-谷氨酰胺與B. cellulsilyticus正相關(guān)，L-谷氨酸與B.ovatus和B.cellulosilyticus負(fù)相關(guān)，L-谷氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸與E. coli正相關(guān)（圖5 A）。

Rmcorr分析代謝物和臨床指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)兩個隊列中L-纈氨酸和L-谷氨酸與體重和BMI顯著正相關(guān)，F(xiàn)BG與L-谷氨酰胺顯著負(fù)相關(guān)，與L-谷氨酸正相關(guān)（圖5 B）。

為進(jìn)一步探究腸道菌群的BCAAs、L-谷氨酸和L-谷氨酰胺的合成和降解能力的變化，選取與這些功能相關(guān)的KOs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腸道菌群的L-亮氨酸和L-異亮氨酸的合成和降解功能、L-纈氨酸的降解功能無顯著性變化；而與L-纈氨酸合成相關(guān)的KO0835（纈氨酸-丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶 [EC:2.6.1.66]）和K14260（丙氨酸合成轉(zhuǎn)氨酶 [EC:2.6.1.2]）降低，且這兩個KO均與Proteobacteria的減少有關(guān)。與L-谷氨酸轉(zhuǎn)化成L-谷氨酰胺相關(guān)的KO1915（谷氨酰胺合成酶 [EC:6.3.1.2]）顯著升高，而KO1915與Bacteroidetes的升高有關(guān)；而與L-谷氨酰胺降解相關(guān)的KOs無顯著性變化。接著將這三個KOs和三個代謝產(chǎn)物進(jìn)行了spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)L-纈氨酸和L-谷氨酸與KO1915（與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝相關(guān)的map00250）負(fù)相關(guān)，與KO0835和K14260（與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成相關(guān)的map00290）正相關(guān)（圖5 C）；而L-谷氨酰胺與KO1915非顯著正相關(guān)，與KO0835和K14260非顯著負(fù)相關(guān)。

那么L-纈氨酸、L-谷氨酸和L-谷氨酰胺是否可以解釋或介導(dǎo)腸道菌群（即B. ovatus, E. coli）對臨床指標(biāo)（即FBG、BMI、BW）的影響？通過中介分析發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸能介導(dǎo)B. ovatus 和FBG間的負(fù)作用，而L-谷氨酸和L-纈氨酸能介導(dǎo)E. coli和FBG間的正作用（圖5 D）；此外，L-谷氨酸和L-纈氨酸還能介導(dǎo)B. ovatus與BMI和BW間的負(fù)作用，E. coli與BMI和BW間的正作用（圖5 D）。但L-谷氨酰胺對B. ovatus和E. coli與臨床指標(biāo)（即FBG、BMI、BW）沒有顯著的中介作用。由此可知，L-纈氨酸和L-谷氨酸在中等海拔暴露個體中可能介導(dǎo)了B .ovatus和E. coli對臨床指標(biāo)（即FBG、BMI、BW）的影響。
 

圖5 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

2.6 菌群移植實驗驗證中等海拔暴露個人的腸道菌群能夠緩解HFD小鼠T2DM的發(fā)展
為進(jìn)一步研究中等海拔暴露個體的腸道菌群對AAs和FBG的影響，隨機(jī)選擇6名入藏前、6名入藏后12個月的志愿者的糞便，制成勻漿灌胃給HFD C57BL-6J小鼠（圖6 A），分為對照組小鼠（HFD + ME 0M組）和干預(yù)組小鼠（HFD + ME 12M組）。研究發(fā)現(xiàn)兩組間的飲食攝入量不受菌群移植操作的影響。（HFD + ME 12M）組小鼠體重增長率降低（圖6 B），脂肪組織重量降低（圖6 C）。白色脂肪組織的組織切片顯示，(HFD+ME 12M)組的脂肪細(xì)胞直徑明顯小于(HFD+ME 0M)組（圖6 D）；(HFD+ME 12M)組的白色脂肪組織中參與脂肪生成的基因（包括Srebf1、Scd1和Fasn）顯著較低，而參與脂肪分解和脂肪酸氧化的基因（包括Adrb3、Pnpla2、Acox1和Ppargc1a）升高（圖6 E）。此外，炎癥因子（Cd68、Ccl2、IL-6和IL-1β）在(HFD+ME 12M)組的脂肪組織中表達(dá)減弱，表明炎癥狀態(tài)有所改善（圖6 F）�？诜�葡萄糖耐量實驗(Oral Glucose Tolerance Test, OGTT)顯示（HFD + ME 12M）組中在改善葡萄糖不耐受方面沒有好的效果。盡管通過胰島素耐量試驗(Insulin Tolerance Test, ITT)的葡萄糖濃度曲線下面積(Area Under the glucose concentration Curve, AUC)顯示胰島素敏感性無顯著性改變，但胰島素抵抗指標(biāo)(Homeostasis Model assessment of Insulin Resistance，HOMR-IR)在(HFD+ME 12M)組中降低。非常重要的是，在(HFD+ME 12M)組中，F(xiàn)BG水平在菌群移植后6周就出現(xiàn)顯著降低且胰島素水平顯著降低（圖6 I、J）；但瘦素和脂聯(lián)素在兩組間無差異。AAs檢測結(jié)果顯示(HFD+ME 12M)組中的L-谷氨酸和L-天冬氨酸顯著降低，L-谷氨酰胺顯著升高（圖6K、L），而L-纈氨酸變化不顯著。16S rDNA擴(kuò)增子數(shù)據(jù)表明，菌群移植后小鼠的腸道菌群組成與供體的腸道菌群組成相似；在第8周時，(HFD+ME 12M)組的Firmicutes/Bacteroidetes顯著低于(HFD+ME 0M)組，但兩組間Proteobacteria的相對豐度未發(fā)生顯著變化。此外，通過用微生物數(shù)據(jù)建立的OPLS回歸模型可以很好地預(yù)測受體小鼠的臨床指標(biāo)變化，尤其是FBG、胰島素、 L-谷氨酸和L-天冬氨酸水平，但不能預(yù)測L-谷氨酰胺水平（圖6 M-P），表明糞便捐獻(xiàn)者的腸道菌群組成能夠較好地預(yù)測出受試者的臨床指標(biāo)變化。FBG和HOMR-IR的減少表明腸道菌群在調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)代謝方面有重要的因果作用。
 

圖6 腸道菌群移植對HFD小鼠代謝表型的影響