期刊：Gut Microbes
影響因子：12.2
伯豪技術(shù)服務(wù)：RNA-seq

導(dǎo)讀
纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分之一，是一種復(fù)雜的多糖，由β1，4-糖苷鍵連接的D-吡喃葡萄糖基殘基骨架組成。纖維素在哺乳動物的腸道中既不能被消化也不能被吸收，只有通過纖維素溶解的微生物與其宿主之間建立的共生關(guān)系才能被降解。越來越多的證據(jù)表明，纖維素可以被反芻食草哺乳動物和雜食哺乳動物（包括人類）共生的纖維素溶解的細(xì)菌消化。

科學(xué)問題
由人類腸道微生物基因組可編碼并分泌纖維素酶，該酶可以消化纖維二糖。目前，針對纖維素酶研究或是纖維素溶解的分子機制尚不明確。

研究技術(shù)
RNA-seq，16S rRNA sequencing

方法
本文使用纖維二糖作為造模劑，其能促進人類腸道關(guān)鍵菌群（如：卵形擬桿菌（Bacteroides ovatus，BO））生長從而進一步研究共生機制。采用RNA-seq發(fā)現(xiàn)可能存在的新酶；同時，我們還通過16S rRNA測序分析了纖維素糖對小鼠腸道菌群組成的影響。

結(jié)論
發(fā)現(xiàn)了BO的一個新的多糖利用位點（polysaccharide utilization locus，PUL），PUL參與了纖維二糖的捕獲和降解。此外，還檢測細(xì)胞表面上兩種新的纖維素酶BACOVA_02626^GH5和BACOVA_0630^GH5，兩種酶能將纖維二糖降解為葡萄糖。

技術(shù)路線圖

研究結(jié)果
1. 纖維二糖促進卵形擬桿菌和益生菌的生長
分別用纖維二糖和纖維四糖處理不同細(xì)菌進行對比，設(shè)計3個分組：卵形擬桿菌組（Bacteroides ovatus，BO），纖維素類桿菌組（Bacteroides cellulosilyticus，BC）和益生菌組（ 包含：羅伊乳桿菌（Lactobacillus reuteri，LR）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum，BL））。

實驗結(jié)果顯示BO在2.5 mg/mL和5 mg/mL纖維二糖上生長良好。BC生長非常緩慢，并且在纖維二糖培養(yǎng)96 h，最大OD600值幾乎只有在BO的一半。益生菌組在5 mg/mL纖維二糖上生長良好，58 h時最大OD600值分別約為1、0.7和0.5。結(jié)果表明，BO在5 mg/mL纖維四糖上能短時間生長，24 h時最大OD 600值約為0.4。然而，BC組和益生菌組均不能在纖維素上生長。

2. 纖維素二糖被卵形擬桿菌降解為葡萄糖
為了探索纖維二糖是否能降解為葡萄糖，采用纖維二糖與BO共培養(yǎng)的上清液，通過薄層色譜（TLC）分析。然而，無法從上清液中檢測到葡萄糖。因此，考慮認(rèn)為纖維二糖可能被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中以進一步消化降解。后續(xù)設(shè)計BO與葡萄糖（作為A組）或纖維二糖（作為B組）分別進行共培養(yǎng)，同時利用蛋白酶K破壞細(xì)胞膜進行對比。結(jié)果顯示，在A組中不能檢測到葡萄糖，而在B組中可以檢測到葡萄糖，而用蛋白酶K處理6 h的細(xì)胞產(chǎn)生的葡萄糖較少，用蛋白酶K處理12 h后沒有產(chǎn)生葡萄糖。上述結(jié)果表明纖維二糖被BO降解為葡萄糖，而降解過程依賴的酶可能定位在細(xì)胞膜上。
 

3. 卵形擬桿菌基因組中兩個離散的多糖利用位點（PULs）被纖維二糖激活
設(shè)計分組葡萄糖和纖維二糖和BO分別共培養(yǎng)，然后提取BO的RNA，進行原核轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）。

結(jié)果顯示在纖維二糖組中有19個基因顯著上調(diào)，且該基因分布在兩個離散的PUL，包括PUL1（BACOVA_20624-BACOVA_02638）和PUL2（BACOVE_02741-BACOVA_02745），這兩個PUL通過RTqPCR進一步驗證。PUL1由15個基因組成，包括一對SusC/SusD（轉(zhuǎn)運蛋白/聚糖結(jié)合蛋白）、糖苷水解酶（GH5和GH2）。PUL2由五個基因組成，主要包括兩個糖苷酶水解（GH16和GH3）。
 

4. 發(fā)現(xiàn)兩種可降解纖維二糖的新型纖維素酶
為了確定哪種PUL介導(dǎo)纖維二糖的降解，純化了每種PUL編碼的重組蛋白，并制備了相應(yīng)的多克隆抗體。結(jié)果顯示，BACOVA_2626^GH5、BACOVA_02630^GH5、BACOVA_2631^GH2和BACOV-A_02745^GH3在纖維二糖存在下特異性表達。利用蛋白酶K去除細(xì)胞表面蛋白，BACOVE_2626^GH5，BACOVA_0630^GH5和BACOVA_02740^GH3均不能用蛋白質(zhì)印跡法檢測到。通過高效陰離子交換色譜檢測，進一步驗證BACOVA_2626^GH5、BACOVA_02630^GH5和BACOVA_02745^GH3可以將纖維二糖消化為葡萄糖。
 

5. BACOVA_02626^GH5 和BACOVA_02630^GH5結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示與土壤細(xì)菌有同源性
上述三種酶中，BACOVA_02745^GH3在過去已有文章報告過，作為纖維二糖的降解酶活性比較弱，因此后續(xù)就另外兩種展開研究。BACOVA_02626^GH5和BACOVA_0630^GH5的殘基置信度分?jǐn)?shù)高的紙箱結(jié)構(gòu)分別用粉紅色或藍色展示。進一步預(yù)測BACOVA_02626^GH5和BACOVA_0630^GH5點位置和催化口袋。預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)BACOVA_2626^GH5催化袋可結(jié)合Ser 276、Trp 54、Asn 153、Glu 154、Tyr 215、Glu 241、Cys 284、Glu 281；BACOVA_02630^GH5，催化袋可結(jié)合Glu 293、Tpr 324、Asn 180、Phe 126、Arg 85、Tyr 248、Phe 49組成。
 

6. 纖維素酶重塑低纖維飲食小鼠腸道微生物群的組成
為了探索纖維二糖對低纖維飲食小鼠腸道微生物群的影響，低纖飲食小鼠每隔一天用纖維二糖口服處理。我們觀察到纖維二糖改善了體重減輕。基于LEfSe分析，比較兩組屬水平差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維二糖處理后，另枝菌屬（Alistipes ）顯著增加。

7. 細(xì)菌的代謝功能可能被改變，并可能有助于抑制炎癥
MetaCyc數(shù)據(jù)庫分析49差異異最大的代謝通路。這一結(jié)果表明，纖維二糖能特異性激活微生物組代謝通路。此外，通過Tax4Fun工具預(yù)測了與碳水化合物代謝相關(guān)的酶。與對照組相比，只有β-N-乙酰己糖苷酶、α-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶顯示出差異。此外，通過PICRUSt1預(yù)測了KEGG通路。纖維二糖處理后，代謝相關(guān)的KEGG途徑（包括組氨酸、甲烷、維生素B6和葉酸生物合成）顯著富集。過去已有文獻表明，β-N-乙酰己糖胺酶和組氨酸（由羅伊氏乳桿菌代謝為組胺）已被證明可抑制結(jié)腸炎癥。因此，分析結(jié)腸組織中TNF-α和IL-6等促炎因子。我們發(fā)現(xiàn)纖維二糖處理后，TNF-α和IL-6的mRNA表達水平顯著降低。由于組氨酸代謝途徑顯著富集，還分析了組胺H2受體（H2R）。結(jié)果顯示，纖維二糖給藥后，H2R的mRNA表達水平顯著增加。此外，通過IHC進一步驗證TNF-α和IL-6的蛋白質(zhì)水平，結(jié)果表明纖維二糖處理后IL-6和TNF-α降低。綜上結(jié)果，纖維二糖可以改變腸道微生物的代謝途徑，但是這種改變對于腸道炎癥的影響尚不明確還需要結(jié)合宿主本身的研究作為支持。

參考文獻：
Li M, Wang Y, Guo C, et al. The claim of primacy of human gut Bacteroides ovatus in dietary cellobiose degradation. Gut Microbes. 2023;15(1):2227434. doi:10.1080/19490976.2023.2227434