期刊：Nano Today
影響因子：17.4
伯豪產(chǎn)品服務(wù)：mRNA-seq

導(dǎo)讀
皮膚缺損區(qū)毛囊的再生仍然是世界各地的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。由于毛囊采集困難，目前還沒有有效的策略來解決這一問題。在此，作者設(shè)計(jì)了一種基于鉬酸鈣（CM）納米顆粒的生物墨水，其中含有真皮乳頭細(xì)胞（DPCs）和巨噬細(xì)胞。通過釋放鉬（Mo）離子，建立了一個(gè)抗炎的微環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物活性離子介導(dǎo)的毛發(fā)再生的良好免疫調(diào)節(jié)。研究表明，在含有CM納米顆粒的多細(xì)胞生物墨水中，Mo將巨噬細(xì)胞極化為M2表型，從而抑制抗炎細(xì)胞因子。此外，該支架的抗炎免疫微環(huán)境誘導(dǎo)DPCs分泌毛囊生長原相關(guān)細(xì)胞因子，促進(jìn)體內(nèi)毛發(fā)再生。最后，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了Mo激活巨噬細(xì)胞中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路并上調(diào)生長因子（HGF和IGF-1）的表達(dá)的潛在機(jī)制。通過裸鼠創(chuàng)面、皮下植入和小鼠的雄激素脫發(fā)三種動(dòng)物模型證實(shí)了該支架的免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)毛發(fā)再生作用。

研究技術(shù)
mRNA-seq

技術(shù)路線圖

研究結(jié)果
1.含鉬酸鈣（CM）納米顆粒生物墨水的制備和細(xì)胞活性
開發(fā)了一種具有毛囊再生功能的新型生物墨水，將CM納米顆粒與不同濃度的GG（gelatin + GelMA）基質(zhì)生物墨水混合，制備生物墨水。本研究采用DPCs和巨噬細(xì)胞（RAW 264.7 cells），研究免疫調(diào)節(jié)對(duì)毛發(fā)再生的機(jī)制。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞生長良好并增殖。同時(shí)研究了單培養(yǎng)支架中DPCs的基因相對(duì)表達(dá)水平（圖1c）。PDGF-A、PDGF-B、C-Myc、VEGF的表達(dá)跟0CM-GG-D組相比，50CM-GG-D組、250CMGG-D組和500CM-GG-D組上調(diào)。PDGF已被證明在卵泡發(fā)育和血管生成中至關(guān)重要。PDGF-A和PDGF-B作為PDGF家族的兩個(gè)主要成員，可以誘導(dǎo)和維持頭發(fā)循環(huán)的生長期。綜上所述，CM有利于DPCs毛囊生相關(guān)基因的表達(dá)。

為了研究CM納米顆粒介導(dǎo)的免疫環(huán)境，將RAW 264.7細(xì)胞加入到生物墨水中，制備了一系列支架。培養(yǎng)21天后，RAW 264.7細(xì)胞在含50和250 μg/mL CM的單培養(yǎng)支架中的增殖作用明顯高于無CM的支架。（圖1d)。對(duì)支架中的RAW 264.7細(xì)胞進(jìn)行分離、收集，并進(jìn)行免疫染色，分析CD206的表達(dá)情況。與0CM-GG-D組相比，50CM-GG-D、250CM-GG-D和500組CD206的熒光強(qiáng)度明顯上調(diào)。其中，250CM-GG-D組的CD206表達(dá)最強(qiáng)�；�因分析的結(jié)果與免疫熒光染色圖像一致這些結(jié)果表明，CM能夠觸發(fā)更多的M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物和抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，顯示出CM在刺激巨噬細(xì)胞向抗炎M2表型方面的顯著有效性。
 

2. 生物打印多細(xì)胞支架對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)作用
將CM納米顆粒加入到濃度為250 μg/mL（250CM-GG）的生物墨水中，之后將DPCs和RAW 264.7細(xì)胞分別加入到生物墨水中。接下來，打印了一系列不同細(xì)胞比例的多細(xì)胞支架：RAW 264.7細(xì)胞數(shù)量為DPCs細(xì)胞數(shù)量的1/2（Co-D-1/2 R）、1/3（Co-D-1/3 R）和1/5（Co-D-1/5 R）。選擇僅含DPCs的支架作為對(duì)照組（Mono-D）。在培養(yǎng)7天后，檢測支架中細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)情況。PDGF-A、PDGF-B、C-Myc和VEGF的表達(dá)明顯高于Mono-d組。生長因子，如肝細(xì)胞生長因子（HGF）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1），在脫發(fā)治療中發(fā)揮了重要作用，因此，還檢測了RAW 264.7細(xì)胞在多細(xì)胞支架中的HGF和IGF-1基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)Co-D-1/3 R誘導(dǎo)了良好的免疫微環(huán)境，從而促進(jìn)了分泌與促進(jìn)毛囊再生相關(guān)的細(xì)胞因子。
 

3. CM誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用的作用機(jī)制
為了探討Mo離子對(duì)巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的潛在機(jī)制，分別制備了僅含有RAW 264.7細(xì)胞（簡稱3D-R-control）和同時(shí)含有RAW 264.7細(xì)胞和CM的3D支架（簡稱3D-R-CM）。培養(yǎng)7天后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。主成分分析（PCA）顯示，差異基因表達(dá)與CM的存在與否顯著相關(guān)，提示RAW 264.7細(xì)胞的基因表達(dá)可以被CM的支架調(diào)控。比較了兩組差異表達(dá)基因（DEGs），熱圖和火山圖顯示，3D-R-CM中有756個(gè)上調(diào)基因和1638個(gè)下調(diào)基因，表明基因表達(dá)差異范圍廣泛。然后，進(jìn)行GO分析，探討其生物學(xué)功能可能會(huì)影響細(xì)胞凋亡和巨噬細(xì)胞分泌生長因子等生物過程等。對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG富集分析，mTOR、PPAR信號(hào)在上調(diào)的通路，已被證實(shí)與M2表型激活有關(guān)。相反，M1表型激活相關(guān)通路如TNF和MAPK信號(hào)通路在下調(diào)的通路中。

CM的加入可顯著促進(jìn)M2表型相關(guān)基因和毛囊生長期相關(guān)基因。加入mTOR抑制劑后，基因表達(dá)水平下調(diào)到未加入CM的對(duì)照組。RAW 264.7細(xì)胞中IRS1、PI3K、mTOR、Rho和ROCK2的基因表達(dá)受到CM刺激的正調(diào)控，這些關(guān)鍵分子表明了mTOR通路的激活。因此，Mo離子激活的mTOR信號(hào)通路在免疫調(diào)節(jié)性毛發(fā)再生中起到了重要作用。
 

4. 生物打印多細(xì)胞支架對(duì)體內(nèi)毛囊再生和傷口愈合的影響
首先研究了該支架對(duì)裸鼠皮膚缺損模型中創(chuàng)面愈合和毛囊再生的影響。將這些支架移植到裸鼠的急性皮膚創(chuàng)面（10 mm）上。將裸鼠隨機(jī)分為5組：無支架（Blank）、不含DPCs和CM的支架（GG）、僅含DPCs的支架（GG-D）支架、含CM和DPCs的支架（CM-GG-D）、含CM、DPCs和RAW 264.7細(xì)胞的支架（CM-GG-Co、DPCs和RAW 264.7細(xì)胞，比例為3：1）。14天內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面宏觀照片和創(chuàng)面面積統(tǒng)計(jì)圖，說明GG-D、CM-GG-D、CM-GG-Co組均表現(xiàn)出良好的創(chuàng)面愈合效果�？瞻捉M在第14天顯示未完全上皮化，明顯未愈合的缺損。特別是CM-GG-Co組的創(chuàng)面缺損完全閉合。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含CM的支架可誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，并在傷口周圍建立抗炎微環(huán)境。當(dāng)小鼠飼養(yǎng)到40天時(shí)，CM-GG-D和CM-GG-Co處理的小鼠背部有新生毛發(fā)，而Blank組、GG組和GG-D組沒有毛發(fā)。值得注意的是，與CM-GG-D組相比，CM-GG-Co組實(shí)現(xiàn)了更多的毛囊和毛發(fā)再生。提示RAW 264.7細(xì)胞與DPCs相互作用所誘導(dǎo)的治療效果優(yōu)于單獨(dú)作用的DPCs。

為了研究CM的免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)生物3D打印進(jìn)行了皮下植入。ELISA檢測第4天和第7天支架周圍組織中TNF-a、IL-4、KGF、PDGF-A和C-Myc的分泌水平。與預(yù)期的一樣，用含有CM的支架（CM-GG-D和CM-GG-Co）處理的組織在第4天和第7天分泌的促炎細(xì)胞因子TNF-a要少得多，但分泌的抗炎IL-4更多。用含有DPCs的支架處理的組織在第4天分泌了更多的KGF、PDGF-A和C-Myc。與第4天相比，ELISA結(jié)果在第7天有更明顯的變化趨勢。

為進(jìn)一步證實(shí)毛囊再生效果，并通過肉眼觀察毛發(fā)再生情況，建立了雄激素性脫發(fā)（AGA）小鼠模型。同樣，AGA小鼠隨機(jī)分為5組：無支架（Blank）、無DPCs和CM的支架（GG）的支架、含DPCs和RAW 264.7細(xì)胞（GG-Co）的支架、含CM的支架（CM-GG）、含CM、DPCs和RAW 264.7細(xì)胞的支架（CM-GG-Co、DPCs和RAW 264.7細(xì)胞，比例為3：7）。隨著時(shí)間的推移，毛發(fā)再生狀態(tài)的視覺外觀顯示，Blank組和GG組直到第40天才沒有明顯的新生毛發(fā)，而其他組，特別是CM-GG-Co處理的小鼠再生了大量的毛發(fā)，CM-GG-Co獲得了最顯著的再生毛發(fā)覆蓋度。CM-GGCo組在細(xì)胞增殖、毛囊形成和毛發(fā)再生等各個(gè)階段均表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢�？偟膩碚f，所獲得的含有CM的多細(xì)胞支架具有免疫調(diào)節(jié)和體內(nèi)毛發(fā)再生的能力，這是重建復(fù)雜皮膚附件的新策略的重大進(jìn)展。
 

參考文獻(xiàn)：
Jinfu Wu, Jingge Ma, Hui Zhuang et al.3D bioprinting of calcium molybdate nanoparticles-containing  immunomodulatory bioinks for hair regrowth.[J] .Nano Today, 2023,101917.