期刊：Arthritis and Rheumatology
影響因子：13.3
伯豪技術(shù)服務(wù)：時(shí)空組學(xué)

研究背景
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一類自身免疫性疾病，其主要以多關(guān)節(jié)滑膜炎、血管翳形成以及軟骨與骨侵蝕為主要病理表現(xiàn)。生物制劑（bDMARDs）的應(yīng)用讓大部分RA患者受益，但是仍然有30%-40%的患者對(duì)多種bDMARDs反應(yīng)較差，揭示了RA中存在潛在的且未被重視的通路和靶點(diǎn)，以及對(duì)這些通路和靶點(diǎn)進(jìn)行深入探索的必要性。與長期處于緩解期的RA患者相比，活動(dòng)期的RA患者關(guān)節(jié)破壞的風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)程明顯增加。因此，解析RA患者關(guān)節(jié)局部免疫微環(huán)境在活動(dòng)期和緩解期的差異性，探索關(guān)節(jié)破壞的發(fā)生過程，對(duì)于保護(hù)RA患者的關(guān)節(jié)至關(guān)重要。

研究技術(shù)
ScRNA-SEQ，ST

研究內(nèi)容
結(jié)合單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，本研究對(duì)來自 3 名復(fù)發(fā) RA 患者和 3 名緩解期患者的 6 個(gè)匹配的滑膜組織樣本進(jìn)行了測序。使用 scRNA-seq 鑒定內(nèi)襯和亞襯 FLS 子集；分析了復(fù)發(fā)期和緩解期之間 FLS 子集轉(zhuǎn)錄組的差異。差異分析表明，復(fù)發(fā)性 RA 患者的內(nèi)膜 FLS 中成纖維細(xì)胞生長因子 (FGF) 通路高度激活，mIHC 證實(shí) FGF10 表達(dá)增加。雖然 I 型干擾素通路也在內(nèi)層 FLS 中被激活，但體外刺激實(shí)驗(yàn)表明它獨(dú)立于 FGF10 通路。FLS 中 siRNA 敲低 FGF10 顯著降低 RANKL 的表達(dá)。此外，重組 FGF10 蛋白增強(qiáng)了原代人源血管翳細(xì)胞培養(yǎng)物中的骨侵蝕，而 FGFR1 抑制劑則減弱了這一過程。最后，施用 FGFR1 抑制劑在 CIA 大鼠模型中顯示出治療效果。

技術(shù)路線圖

圖1

2. 復(fù)發(fā)和緩解 RA 的 FLS 子集顯示出不同的激活途徑
鑒于 FLS 在 RA 發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用，研究特別關(guān)注 FLS 亞群在 RA 復(fù)發(fā)和緩解中的作用。經(jīng)過質(zhì)量控制，獲得了 22,679 個(gè)高質(zhì)量的 FLS，根據(jù)差異表達(dá)基因 (DEG) 將其分為四個(gè)子集：CD55+ 襯里成纖維細(xì)胞 (FB L-CD55)、CXCL12+ 亞襯成纖維細(xì)胞 (FB S-CXCL12)（圖 2A 和 C） 、MFAP5+ 亞襯成纖維細(xì)胞 (FB S-MFAP5) 和 VEGFA+ 亞襯成纖維細(xì)胞 (FB S-VEGFA)（圖 2A）。通過整合單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)和公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，觀察到復(fù)發(fā)性 RA 中 CD55+ 內(nèi)襯成纖維細(xì)胞的比例很高，這表明內(nèi)膜成纖維細(xì)胞在復(fù)發(fā) RA 中顯著增殖（圖 2B）。通過對(duì)DEG 進(jìn)行聚類來生成熱圖，以深入了解復(fù)發(fā)和緩解 RA 中 FLS 的四個(gè)子集的分子特征差異（圖 2D）。發(fā)現(xiàn) FB L-CD55 和 FB S-CXCL12 在復(fù)發(fā)和緩解 RA 之間存在顯著差異。FB L-CD55 表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP) 和脂多糖結(jié)合蛋白 (LBP) 相關(guān)的基因， MMP加速軟骨降解， LBP表明復(fù)發(fā) RA 中先天免疫反應(yīng)的上調(diào)（圖 2D）。FB S-CXCL12 在復(fù)發(fā)性 RA 中表達(dá)與 MHC II 類呈遞和補(bǔ)體激活途徑 (C3) 相關(guān)的基因（圖 2D）。接下來，研究基于 Hallmark 和 Reactome 數(shù)據(jù)集對(duì) FLS 子集進(jìn)行了通路分析（圖 2E）。發(fā)現(xiàn)，來自復(fù)發(fā)性 RA 的 FB L-CD55 中的干擾素 α (IFN-α)、干擾素 γ (IFN-γ) 和成纖維細(xì)胞生長因子受體 1 (FGFR1) 通路高度激活。在緩解期 RA 中，F(xiàn)B L-CD55 和 VEGFA+ 成纖維細(xì)胞 (FB S-VEGFA) 中高度富集凋亡和缺氧途徑。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)LS 亞群具有不同的基因表達(dá)模式，受不同的復(fù)發(fā)和緩解 RA 途徑調(diào)節(jié)。
 

圖2

3. FGF10-FGFR1信號(hào)通路在復(fù)發(fā)性RA的內(nèi)層FLS中異常激活
CellChat 分析顯示，F(xiàn)B L-CD55 與復(fù)發(fā) RA 中的其他 FLS 子集具有強(qiáng)烈的 FGF 信號(hào)通路相互作用（圖 3A）。此外，研究觀察到 FGF10-FGFR1 對(duì)在復(fù)發(fā) RA 的 FB L-CD55 中高度激活（圖 3B，左）。對(duì)于亞襯FLS，F(xiàn)GF7-FGFR1 對(duì)占主導(dǎo)地位；然而，復(fù)發(fā)和緩解 RA 之間沒有明顯差異（圖 3B，右）。對(duì)不同 FLS 亞群中 FGF7、FGF10 和 FGF14 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平的進(jìn)一步分析表明，F(xiàn)GF10 在復(fù)發(fā) RA 的 FB L-CD55 細(xì)胞中高表達(dá)（圖 3C）。使用 mIHC，研究確認(rèn) PDPN+FGF10+ FLS 主要在復(fù)發(fā) RA 的血管翳內(nèi)層中檢測到（圖 3D）。通過 IHC 對(duì)復(fù)發(fā)和緩解 RA 患者的 12 個(gè)血管翳樣本中的 FGF10 表達(dá)進(jìn)行定量分析顯示，復(fù)發(fā) RA 患者中 FGF10 陽性區(qū)域的比例顯著高于緩解 RA 患者（圖 3E 和 F）。通過結(jié)合 scRNAseq 和 IHC 數(shù)據(jù)，證明了復(fù)發(fā) RA 內(nèi)膜 FLS 中 FGF10-FGFR1 信號(hào)通路的過度激活。
 

圖3

4. IFN-α和FGFR1信號(hào)通路在復(fù)發(fā)性RA中很大程度上是獨(dú)立的
鑒于 IFN-α 和 FGFR1 信號(hào)通路主要在復(fù)發(fā) RA 的內(nèi)層 FLS 中激活，本研究探討了這兩種通路之間是否存在交叉調(diào)節(jié)。首先，通過比較來自 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的 FLS 中的兩個(gè)通路評(píng)分來進(jìn)行相關(guān)性研究。未觀察到 IFN-α 和 FGFR1 信號(hào)通路與總 FLS 或復(fù)發(fā)或緩解 RA 的 FLS 之間存在任何已建立的相關(guān)性 (R>0.3)（圖 4A 和 B）。這些結(jié)果表明這兩條途徑在單細(xì)胞水平上很大程度上是獨(dú)立的。

為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行了體外刺激實(shí)驗(yàn)。用重組人干擾素α2a（IFN-α2a）或FGF10蛋白刺激MH7A FLS細(xì)胞系6小時(shí)，并通過qRT-PCR測量目標(biāo)分子。與未刺激的對(duì)照組相比，IFN-α2a刺激MH7A FLS細(xì)胞系以劑量依賴性方式誘導(dǎo)了預(yù)期的IFI6和ISG15 mRNA表達(dá)；然而，沒有觀察到 FGF10 mRNA 的顯著變化（圖 4C）。同時(shí)，用 10 ng/ml 和 100 ng/ml FGF10 刺激 MH7A FLS 細(xì)胞系對(duì) IFI6 和 ISG15 mRNA 的表達(dá)幾乎沒有影響（圖 4D）。總的來說，本研究提供了初步證據(jù)表明 IFN-α 和 FGFR1 信號(hào)通路不太可能相互交叉調(diào)節(jié)。
 

圖4

5. 襯里 FLS 中的 IFN-α 和 FGFR1 信號(hào)通路與復(fù)發(fā) RA 中的不同代謝通路存在差異相關(guān)
既往對(duì)RA和OA滑膜成纖維細(xì)胞代謝的研究表明，缺氧和糖酵解是RA滑膜成纖維細(xì)胞的特征。研究觀察到復(fù)發(fā)和緩解 RA 中的 FLS 亞群表現(xiàn)出不同的代謝活動(dòng)（圖 5A）。在襯里成纖維細(xì)胞（FB L-CD55）中高度富集的代謝途徑中，花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、氧化磷酸化、泛酸和CoA生物合成在復(fù)發(fā)性RA中占主導(dǎo)地位。相比之下，煙酸鹽和煙酰胺代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝以及糖酵解/糖異生在 RA 緩解中普遍存在。

相關(guān)分析顯示，IFN-α信號(hào)通路與亞油酸、α-亞麻酸和花生四烯酸代謝密切相關(guān)（圖5B和C）。相反，F(xiàn)GFR1信號(hào)通路與代謝通路的相關(guān)性較小，與賴氨酸降解和粘蛋白型O-聚糖生物合成的相關(guān)性較弱（圖5B和D）。這些數(shù)據(jù)表明 IFN-α 和 FGFR1 信號(hào)通路與復(fù)發(fā)性 RA 襯里 FLS 中的不同代謝通路相關(guān)。
 

圖5

6. 阻斷 FGFR1 信號(hào)通路可減輕體外骨侵蝕，并在大鼠關(guān)節(jié)炎模型中顯示治療效果
研究進(jìn)行 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)來探討 FGF10/FGFR1 信號(hào)在 FLS 侵襲性中的潛在作用。與siNC和siFGF7相比，siFGF10顯著抑制FLS的侵襲能力（圖6A和B）。通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步測量了與 FLS 侵襲性相關(guān)的幾種基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)。結(jié)果顯示，與siFGF7和siNC相比，siFGF10顯著抑制MMP2的表達(dá)（圖6C和D）。基于此，假設(shè) FGF10/FGFR1 信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)復(fù)發(fā)性 RA 中 FLS 的侵襲性，并且 MMP2 參與了這一過程。除了MMP2之外，發(fā)現(xiàn)與siFGF7和siNC相比，siFGF10強(qiáng)烈抑制RANKL的表達(dá)（圖6C和D），這表明FGF10/FGFR1途徑可能參與復(fù)發(fā)性RA的破骨細(xì)胞生成。 
 

圖6