代謝組學探究金納米球GNS調(diào)節(jié)TMAO代謝抗骨質(zhì)疏松中的應用
發(fā)表期刊：Journal of Nanobiotechnology
影響因子：10.2
客戶單位：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院
百趣提供服務：氧化三甲胺高通量靶標
研究背景
骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, OP)是一種代謝性骨病，其特征是骨量減少和骨脆性增加。金納米球(Gold nanospheres, GNS)作為一種常見的金納米顆粒，具有顯著的抗菌抗炎活性，已被應用于治療眼疾病和類風濕性關節(jié)炎。然而，GNS對骨質(zhì)疏松癥的影響仍不明確。有研究表明腸道微生物群可能參與調(diào)節(jié)骨代謝和骨質(zhì)疏松癥的進展，且氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide, TMAO)參與了骨骼健康的維持，但其潛在機制尚不清楚。卵巢切除術(shù)(ovariectomy, OVX)誘導的小鼠骨質(zhì)疏松癥模型已被廣泛用于模擬骨質(zhì)疏松癥的典型臨床表型，因此本研究采用OVX骨質(zhì)疏松小鼠來研究GNS是否對骨質(zhì)疏松癥有治療作用。作者結(jié)合腸道微生物測序和氧化三甲胺的檢測，證明了GNS作為腸道微生物群調(diào)節(jié)劑對骨質(zhì)疏松癥有保護作用，并為“腸-骨”軸的調(diào)節(jié)提供了新的見解。
圖1. 研究流程
組織學分析結(jié)果顯示，GNS給藥對小鼠的腎臟和肝臟沒有不良影響，并具有良好的生物相容性。對股骨小梁和皮質(zhì)骨的輪廓進行µCT分析圖像表明，GNS給藥能夠減輕OVX小鼠的骨丟失（圖2 B）。GNS給藥顯著增加了骨體積/組織比、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度，并減少了骨小梁分離（圖2 C-F）。有趣的是，兩組之間的骨密度沒有顯著差異（圖2 G）。測試皮質(zhì)骨的相關指標，包括皮質(zhì)骨厚度和皮質(zhì)骨面積都沒有顯著差異。血清中的Ⅰ型膠原C端肽(C-telopeptide of type I collagen, CTX-1)被認為是反映骨減少進展的相關生物標志物。因此，測量血清中CTX-1的濃度，發(fā)現(xiàn)GNS給藥顯著降低了CTX-1水平，進一步表明GNS對骨丟失的保護作用（圖2 J）。這些結(jié)果表明，GNS給藥顯著改善了OVX誘導的骨質(zhì)疏松癥。
圖2. GNS給藥改善了OVX誘導的骨質(zhì)疏松癥
02 GNS以腸道微生物群依賴的方式減輕OVX誘導的骨質(zhì)疏松癥
在GNS給藥前使用四種抗生素混合物進行了偽無菌小鼠模型構(gòu)建（圖3 A）。µCT分析表明，ABX(OVX)組與ABX(OVX+GNS)組幾乎無法區(qū)分（圖3 B）。另外GNS給藥對骨質(zhì)疏松癥的有益作用包括：骨體積比、骨小梁數(shù)量、厚度、分離度、骨皮質(zhì)厚度及CTX-1的改變，在沒有腸道微生物的情況下被完全消除（圖3 C-J）。
圖3. GNS給藥對OVX誘導的骨質(zhì)疏松癥的保護作用在腸道微生物群耗竭后消失
通過糞菌移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)方式，隔天灌胃將OVX和OVX+GNS組的微生物群移植到腸道微生物群缺失的野生型小鼠中（圖4 A）。FMT(OVX+GNS)組的骨密度和皮質(zhì)骨面積與FMT(OVX)組相比顯著增加（圖4G、I），但其他指標和µCT圖像顯示兩組之間沒有顯著差異（圖4B-F、H）。這些不顯著的差異結(jié)果可能是由于FM移植實驗中腸道微生物群的損失導致。這些結(jié)果表明，GNS是以腸道微生物依賴的方式減輕了OVX誘導的骨質(zhì)疏松癥。
圖4. 糞便微生物群移植減輕OVX誘導的骨質(zhì)疏松
03 GNS給藥顯著改變了腸道微生物群的多樣性
進一步使用糞便中細菌的16S r測序分析研究了GNS對腸道微生物群多樣性和組成的調(diào)節(jié)作用。如圖5A所示，OVX和OVX+GNS組的糞便中共獲得6124個菌，其中1403個菌在兩組中共有。通過主坐標分析(PCoA)顯示，兩組之間明顯分離，表明OVX+GNS和OVX組的微生物群組成不同（圖5 B-D）。
為了研究兩組之間腸道微生物群的具體變化，在不同水平上評估了每組分類群的相對豐度。如圖5F和5G所示，擬桿菌門和厚壁菌門為兩大優(yōu)勢門，有趣的是，OVX+GNS組中厚壁菌門與擬桿菌門的比例顯著高于OVX組，表明擬桿菌門對GNS的敏感性更高。此外，GNS給藥顯著降低了擬桿菌門的水平，但增加了變形菌門和ℇ變形菌門的水平（圖5 H）。
圖5. GNS給藥顯著改變了腸道微生物群的多樣性
進一步分析屬水平的物種分布，發(fā)現(xiàn)這兩組在腸道微生物群中表現(xiàn)出明顯差異（圖6 A-B）。幽門螺桿菌屬和乳酸桿菌屬在GNS給藥的小鼠中占據(jù)相對較高的比例，而擬普雷沃氏菌屬在OVX+GNS組中顯示出較少的豐度（圖6 C-E）。通過LEfSe和分支圖分析結(jié)果表明，普雷沃氏菌科、擬桿菌門和真桿菌屬是OVX組中促進腸道菌群失調(diào)的重要細菌類型。此外，乳桿菌目、螺旋桿菌科、科氏菌目、水藻科、放線菌門和變形菌門在OVX+GNS組中有相對較高的豐度，這可能是GNS介導的骨質(zhì)疏松癥緩解的關鍵細菌（圖6 F-G）。通過熱圖分析，乳桿菌屬和幽門螺桿菌屬在OVX+GNS組中顯著富集，而異普雷沃菌屬和擬桿菌目在OVX組中所占比例更高，這與LEfSe分析結(jié)果一致（圖6 H）�？傊珿NS給藥影響了腸道菌群的多樣性組成。
圖6. 屬分類水平上OVX和OVX+GNS組的糞便微生物群組成
04 GNS給藥降低了TMAO的豐度
為了探究腸道微生物群的改變是否影響TMAO的產(chǎn)生，作者進行了代謝組學分析。與微生物多樣性結(jié)果一致，OVX+GNS和OVX組具有不同的TMAO特征。在這些代謝產(chǎn)物中，OVX+GNS組的TMA、L-肉堿和TMAO的含量較低。與OVX組相比，OVX+GNS組的總TMAO相關代謝產(chǎn)物在糞便中顯著減少（圖7 A-B）。
為了確定TMAO水平的變化是否與GNS治療誘導的腸道菌群改變密切相關，我們在FMT組之間進行了針對性的TMAO定量分析。OPLS-DA和PCA分析結(jié)果表明兩組之間明顯分離。FMT(OVX+GNS)中TMAO相關代謝物的產(chǎn)生也顯著低于FMT(OVX)組（圖7 C）。FMT(OVX+GNS)組的肌酸酐和氧化三甲胺濃度顯著低于FMT(OVX)組�？傊珿NS給藥通過調(diào)節(jié)腸道微生物群的多樣性來降低代謝產(chǎn)物TMAO的豐度。
圖7. GNS給藥減少了腸道微生物群的TMAO相關代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生
為了更好地確定腸道微生物群和代謝產(chǎn)物TMAO之間的聯(lián)系，作者進行了腸道微生物組和代謝組的聯(lián)合分析。如關聯(lián)分析熱圖所示，17個屬與TMAO相關代謝產(chǎn)物具有顯著相關性，其中12個屬與TMAO相關代謝產(chǎn)物呈正相關，5個屬呈負相關。接著為了進一步展示腸道微生物菌與TMAO相關代謝產(chǎn)物之間的相關性，作者根據(jù)17個屬和TMAO代謝產(chǎn)物構(gòu)建了一個關聯(lián)網(wǎng)絡圖（圖8 B）�？傊�，這些結(jié)果提供了腸道微生物群和TMAO代謝產(chǎn)物之間的關系，這有助于進一步的體外研究。
圖8. 腸道微生物組和代謝組的聯(lián)合分析
05 GNS抑制促炎細胞因子的釋放減輕OVX誘導的骨質(zhì)疏松
骨質(zhì)疏松癥是一種慢性炎癥性疾病，其中IL-1、IL-6和TNF-α等促炎細胞因子通過促進破骨細胞分化和活化以及抑制成骨細胞分化來加速骨丟失。此外，TMAO水平已被證明與促炎細胞因子水平的增加有關。進行了細胞因子微陣列分析，以探討GNS是否誘導血清中不同細胞因子的改變。如熱圖所示，與OVX組相比，OVX+GNS組的促炎細胞因子IL-6、TNF-α和G-CSF顯著降低（圖9 A）�；鹕綀D顯示GNS誘導的差異表達細胞因子與熱圖一致（圖9 B）�？傊�，GNS給藥顯著下調(diào)了促炎細胞因子的釋放，這可能與TMAO的減少有關（圖10）。
圖9. GNS治療顯著改變了OVX小鼠的炎癥細胞因子譜
圖10. GNS通過調(diào)節(jié)微生物群穩(wěn)態(tài)及相關TMAO代謝對OVX誘導的骨質(zhì)疏松癥的保護作用機制示意圖
研究結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)GNS可以以腸道微生物群依賴的方式顯著減輕OVX誘導的骨質(zhì)疏松癥。GNS給藥調(diào)節(jié)了骨質(zhì)疏松癥相關腸道微生物群的多樣性，并降低了TMAO相關代謝產(chǎn)物的豐度，從而進一步降低了骨代謝中促炎細胞因子的水平，最終改善了骨質(zhì)疏松癥狀。另外進行了FMT來證明這種腸道菌群依賴性機制。綜上，GNS可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物群有效改善骨質(zhì)疏松癥，這可能是一種新的、有前景的治療骨質(zhì)疏松的藥物。
