文章題目：Analysis of donor pancreata defines the transcriptomic signature and microenvironment of early neoplastic lesions

中文題目：供體胰腺的分析定義了早期腫瘤病變的轉(zhuǎn)錄組特征和微環(huán)境

見刊時間：2023.06

期刊名稱：Cancer Discovery

影響因子：28.2

實驗平臺：scRNA-seq (10x Genomics)、GeoMx DSP（NanoString）

DOI：10.1158/2159-8290.CD-23-0013
 

技術(shù)路線

文章摘要

由于缺乏在沒有疾病和死后快速降解的情況下從胰腺獲取組織的跡象，因此對成人健康胰腺的研究很少。研究者從腦死亡捐獻者那里獲得胰腺，從而避免了任何熱缺血時間。這 30 名捐贈者年齡和種族各不相同，并且沒有已知的胰腺疾病。對樣本的組織病理學分析顯示，無論年齡如何，大多數(shù)個體都存在胰腺上皮內(nèi)瘤變（PanIN）病變。通過結(jié)合多重 IHC、單細胞 RNA 測序和空間轉(zhuǎn)錄組學，他們首次對成人胰腺的獨特微環(huán)境和散發(fā)性 PanIN 病變進行了表征。他們將健康胰腺與胰腺癌和瘤周組織進行比較，觀察到成纖維細胞和巨噬細胞中不同的轉(zhuǎn)錄組特征。來自健康胰腺的 PanIN 上皮細胞在轉(zhuǎn)錄上與癌細胞非常相似，這表明腫瘤途徑在腫瘤發(fā)生的早期就開始了。
 

 文章結(jié)果 

1、成人胰腺經(jīng)常出現(xiàn) PanIN 病變

研究者從健康成人器官捐贈者那里收集了 30 個胰腺。每個塊的組織病理學分析揭示了 30 個供體標本中的 18 個存在 PanIN以及正常腺泡實質(zhì)、正常導管和腺泡到導管化生區(qū)域（ADM）。

圖1 成人胰腺經(jīng)常出現(xiàn) PanIN 病變

 

2、來自健康個體的 PanIN 被獨特的微環(huán)境包圍

為了表征 PanIN 微環(huán)境的免疫和基質(zhì)組成，研究者對福爾馬林固定、石蠟包埋的組織進行了多重熒光免疫組織化學分析。研究者將 PanIN 等區(qū)域的細胞組成與正常腺泡、導管或 ADM 等區(qū)域進行比較。結(jié)果顯示，PanIN 的形成伴隨著富含成纖維細胞、骨髓細胞和 T 細胞的獨特微環(huán)境的建立，這與組織學上正常的胰腺不同。

為了進一步了解 PanIN 的組成及其微環(huán)境，研究者對 6 個供體器官（總共 44,068 個細胞）進行了單細胞 RNA 測序。組織學分析顯示，4 個胰腺存在 PanIN 病變，而其余兩個胰腺未檢測到病變。研究者對其中骨髓細胞和淋巴細胞進行了進一步分析。多重免疫熒光數(shù)據(jù)顯示，巨噬細胞存在于整個組織中，而 T 細胞更有可能位于 PanIN 附近。隨后研究者又一起分析了成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和周細胞。最后研究者得出結(jié)論，無論是微環(huán)境的免疫成分還是非免疫成分，在供體樣本中都是不同的。正常胰腺包括一組異質(zhì)結(jié)構(gòu)細胞，例如成纖維細胞、周細胞和內(nèi)皮細胞以及免疫細胞。正常人類胰腺還呈現(xiàn)出組織學異質(zhì)性，反映了年齡以及人類生活方式和遺傳學的復(fù)雜性。

圖2 健康胰腺中的 PanIN 病變被獨特的微環(huán)境包圍

圖3 健康的胰腺含有多種非上皮細胞群，包括骨髓細胞、淋巴細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞

 

3.健康胰腺和胰腺腫瘤微環(huán)境的比較揭示了不同的基質(zhì)特征

研究者接下來研究正常胰腺和胰腺癌微環(huán)境的差異。為此，他們將來自健康供體樣本（6 個胰腺；總共11 個樣本）的單細胞 RNA 測序數(shù)據(jù)與從數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)進行了整合。先前發(fā)布的腫瘤 (n=16) 和鄰近正常 (n=3) 樣本的數(shù)據(jù)集。結(jié)果顯示，腫瘤樣本中巨噬細胞和 CD4+ T 細胞的比例較高。腫瘤樣本和正常胰腺中細胞豐度明顯不同。且差異基因分析顯示兩種類型樣本中基因表達存在明顯差異。研究者繪制了與正常樣本相比腫瘤中增加的細胞群之間預(yù)測的配體受體相互作用。結(jié)果檢測到了促胰腺癌發(fā)生相關(guān)的因子。同時，研究者進一步分析了骨髓細胞和成纖維細胞。細胞豐度、基因表達模式以及通路分析提示在健康樣本和腫瘤樣本之間存在明顯差異。這些結(jié)果揭示了微環(huán)境組成部分的差異。

圖4 健康胰腺和胰腺腫瘤微環(huán)境的比較揭示了不同的基質(zhì)特征

圖5 與非腫瘤對應(yīng)物相比，來自荷瘤胰腺的骨髓細胞和成纖維細胞群體表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄組特征

 

4.空間轉(zhuǎn)錄組學揭示了 PanIN 病變的獨特上皮基因特征，該特征與腫瘤上皮密切相關(guān)

為了直接評估 PanIN 的基因表達模式，他們利用了 GeoMx® Digital Spatial Profiler（DSP） 空間轉(zhuǎn)錄組學平臺。研究者從供體胰腺中選擇腺泡、正常導管、ADM 和 PanIN 感興趣區(qū)域 (ROI)。此外，他們還收集了腫瘤附近腺泡和正常導管的 ROI 進行比較。為了避免基質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本混淆，使用全細胞角蛋白 (PanCK) 和 CD45 對每個區(qū)域的樣本進行分割，以選擇所有 ROI 中的 PanCK+/CD45- 細胞，但腺泡 ROI 除外，在其中選擇 PanCK-/CD45-（作為腺泡）細胞不表達 PanCK，并且可以很容易地在組織學上識別。研究者提取了每種細胞類型特有的基因特征�；�因集變異分析 (GSVA)顯示來自其他健康胰腺的散發(fā)性 PanIN 與腫瘤鄰近的 PanIN 相似但又不同。

隨后，研究者將空間轉(zhuǎn)錄組學與單細胞 RNA 測序數(shù)據(jù)相結(jié)合。使用每個 ROI 類別的前 20 個基因，研究者定義了腺泡、導管、ADM、PanIN 和腫瘤細胞的細胞類型特異性基因特征，并將這些特征從單細胞上皮測序數(shù)據(jù)映射到上皮簇。研究者繪制了每個定義特征相對豐富的細胞群圖。

圖6 空間轉(zhuǎn)錄組學揭示了 PanIN 病變的獨特上皮基因特征，該特征與腫瘤上皮密切相關(guān)

 

5.Claudin 18、MUC5AC/B 和 AQP1/3 區(qū)分健康胰腺中的正常導管、ADM 和 PanIN

接下來，研究者驗證供體組織中的基因特征，以確定它們是否準確地識別了不同的上皮細胞群，正如上述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所表明的那樣。研究者選擇了區(qū)分每種上皮細胞類型的標記，包括 AQP1（ADM 特異性）、MUC5B 和 AQP3（正常導管特異性）以及 CLDN18 和 TFF1（PanIN 特異性）的原位雜交探針。研究者將 MUC5AC 作為 PanIN 標記，因為他們的數(shù)據(jù)支持其在非腫瘤樣本中 PanIN 中的獨特表達（與正常導管、ADM 和腺泡細胞相比）。結(jié)果顯示，在同時含有 PanIN 和正常導管的切片中，MUC5B 僅對正常導管染色，而 MUC5AC 對 PanIN 具有特異性。CLDN18 染色在 PanIN 中升高，但在 ADM 中也呈較低程度的陽性。AQP3 僅對正常導管染色，而 AQP1 對 ADM 具有特異性。TFF1 與 CLDN18 在 PanIN 中共表達。最后，PanIN 病變表達高水平的 p-ERK，而 ADM 區(qū)域的 p-ERK 也呈陽性。因此，空間轉(zhuǎn)錄組學衍生的特征定義了個體上皮細胞群，并正確預(yù)測了獨特譜系標記的蛋白質(zhì)表達。

圖7 Claudin 18、MUC5AC/B 和 AQP1/3 區(qū)分健康胰腺中的正常導管、ADM 和 PanIN

 

 文章意義

由于胰腺癌的前驅(qū)病變特征尚不清楚。研究者分析了供體胰腺，發(fā)現(xiàn)前體病變的檢出率遠高于胰腺癌的發(fā)病率，這為闡明抑制或相反促進惡性進展的微環(huán)境和細胞內(nèi)在因素奠定了基礎(chǔ)。