染色體外環(huán)狀DNA (extracchromosomal circular DNA, eccDNA)是一種存在于細(xì)胞核內(nèi)但獨(dú)立于染色體DNA的，封閉環(huán)狀的非質(zhì)粒DNA分子，存在于所有真核生物中。
 
eccDNA在腫瘤的發(fā)病機(jī)制、腫瘤異質(zhì)性的演變和耐藥等方面發(fā)揮著重要作用。eccDNA在歷史上有很多名字，包括非常大型的癌癥特異性環(huán)狀染色體外DNA (ecDNA)，它攜帶致癌基因，經(jīng)常在癌細(xì)胞中擴(kuò)增。eccDNA的長(zhǎng)度從數(shù)十堿基到數(shù)百萬堿基不等。納米孔測(cè)序兼顧長(zhǎng)讀長(zhǎng)與短讀長(zhǎng)測(cè)序，是eccDNA研究的理想技術(shù)。
 
本期齊碳帶您了解近期利用納米孔測(cè)序進(jìn)行eccDNA檢測(cè)的相關(guān)研究。
 
 1.小eccDNA作為多種癌癥診斷和監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物
▲作者:
Noer JB, Hørsdal OK, Xiang X, Luo Y, Regenberg B.
▲DOI: 
10.1016/j.tig.2022.02.007.
 INFORMATION               
▲解讀
小eccDNA具有成為癌癥生物標(biāo)志物的潛力。然而，在癌變過程中小eccDNA的形成機(jī)制和功能尚不清楚，同時(shí)，癌癥患者血漿中的小eccDNA譜是否代表癌組織中的小eccDNA譜仍有待闡明。
 
本研究采用基于納米孔測(cè)序平臺(tái)的新型測(cè)序工作流程，對(duì)25例癌癥患者(包括前列腺癌、肝細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌)和獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列(包括7例癌癥患者血漿和14例健康人血漿)的組織和血漿中存在的小eccDNA的全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序。
   
與非癌組織相比，癌組織中檢測(cè)到的小eccDNA數(shù)量和大小均顯著增加(分別為P = 0.040, P = 2.2e-16)，分布更加均勻，形成機(jī)制也不同。盡管小eccDNA在癌癥組織和配對(duì)的血漿之間具有不同的基礎(chǔ)特征和基因組注釋，但它們具有相似的形成機(jī)制和癌癥相關(guān)功能。來源于某些特定基因的eccDNA在組織(AUC ≥ 0.8)和血漿(AUC > 0.9)有很好的多癌種診斷價(jià)值，特別是與CEA/CA19-9水平結(jié)合時(shí)提高了對(duì)多癌種預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。來自ALK和ETV6的小eccDNA相結(jié)合具有較高的多癌診斷價(jià)值(AUC = 0.804)，可以從組織外推到血漿，在驗(yàn)證隊(duì)列中顯示出較高的陽性預(yù)測(cè)值(100%)和陰性預(yù)測(cè)值(82.35%)。
本研究表明，eccDNA作為一種獨(dú)立、穩(wěn)定的環(huán)狀DNA分子，在組織和血漿中都可以作為理想的生物標(biāo)志物，有潛力用于低成本的多種癌癥診斷和監(jiān)測(cè)。

 
2.eccDNA的純化、全長(zhǎng)測(cè)序和基因組來源定位
▲作者:
Luo X, Zhang L, Cui J, An Q, Li H, Zhang Z, Sun G, Huang W, Li Y, Li C, Jia W, Zou L, Zhao G, Xiao F.
▲DOI: 
10.1002/ctm2.1393.
INFORMATION
▲解讀
染色體外環(huán)狀DNA (eccDNA)是半個(gè)多世紀(jì)前發(fā)現(xiàn)的。然而，對(duì)其生物發(fā)生和功能的研究才剛剛開始。阻礙eccDNA研究的主要障礙之一是很難從細(xì)胞中獲得純的eccDNA。目前的eccDNA純化方法主要依賴于堿法裂解得到粗環(huán)狀DNA后，用核酸外切酶去除線性DNA。然而由于eccDNA的豐度低，尺寸不均勻，目前的純化方法無法獲得純凈的eccDNA。
本研究描述了一個(gè)新的三步eccDNA純化(3SEP)程序，增加了一個(gè)步驟以特異性的恢復(fù)環(huán)狀DNA，同時(shí)不恢復(fù)外切酶未能消化的線性DNA，因此3SEP可以進(jìn)行高純度和可重復(fù)性的eccDNA制備。此外，研究者還開發(fā)了一種將滾環(huán)擴(kuò)增與納米孔測(cè)序相結(jié)合的全長(zhǎng)eccDNA測(cè)序技術(shù)，并相應(yīng)的開發(fā)了一種全長(zhǎng)eccDNA的調(diào)用算法(Flec)用于識(shí)別包含在滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物中的多個(gè)串聯(lián)eccDNA拷貝的共識(shí)序列，并將其映射到基因組相應(yīng)位置。該方案預(yù)計(jì)未來將促進(jìn)eccDNA的鑒定和表征，且具有診斷和臨床應(yīng)用的潛力。
對(duì)于熟練的分子生物學(xué)家來說，純化eccDNA大約需要 1-2天，納米孔文庫(kù)制備和測(cè)序需要5-6天，經(jīng)驗(yàn)豐富的生物信息學(xué)家分析數(shù)據(jù)需要1-5天。
本研究中使用的納米孔測(cè)序方法主要用于鑒定小于10kb的eccDNA。
      3.逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子劫持alt-EJ用于DNA復(fù)制和eccDNA生物發(fā)生
▲作者:
Wang Y, Wang M, Zhang Y.
▲DOI: 
10.1038/s41596-022-00783-7
INFORMATION    
▲解讀
逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（Retrotransposons）在動(dòng)物基因組中高度富集。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的激活可以改寫宿主DNA信息，從根本上影響宿主生物學(xué)。雖然逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的發(fā)育激活可以為宿主提供益處，例如對(duì)抗病毒感染，但不受控制的激活會(huì)促進(jìn)疾病或潛在地推動(dòng)衰老。激活后，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子利用它們的mRNA作為模板合成雙鏈DNA，在宿主基因組中插入新的片段。盡管它們編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶可以合成第一鏈DNA，但第二鏈DNA是如何產(chǎn)生的仍不清楚。
本研究報(bào)道了逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子劫持宿主的選擇性末端連接(alt-EJ) DNA修復(fù)過程，以環(huán)化步驟合成其第二鏈DNA。研究使用納米孔測(cè)序來檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子DNA復(fù)制的命運(yùn)，發(fā)現(xiàn)其中10%實(shí)現(xiàn)了新的插入，而90%以染色體外環(huán)狀DNA (eccDNA)的形式存在。將eccDNA的產(chǎn)生作為標(biāo)示，研究者們通過進(jìn)一步的遺傳篩選確定了來自alt-EJ的因子對(duì)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子復(fù)制至關(guān)重要。alt-EJ通過環(huán)化過程驅(qū)動(dòng)長(zhǎng)末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子DNA的第二鏈合成，因此對(duì)于eccDNA的產(chǎn)生和新的插入是必要的。
該研究表明，alt-EJ在驅(qū)動(dòng)基因組寄生逆轉(zhuǎn)錄元件的增殖中是必不可少的。研究揭示了這個(gè)還未被充分研究的DNA修復(fù)過程的一個(gè)保守功能，并提供了一個(gè)新的視角來理解和潛在地控制逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的生命周期。  
參考文獻(xiàn)：
[1] Noer JB, Hørsdal OK, Xiang X, Luo Y, Regenberg B. Extrachromosomal circular DNA in cancer: history, current knowledge, and methods. Trends Genet. 2022;38(7):766-781.
[2] Luo X, Zhang L, Cui J, et al. Small extrachromosomal circular DNAs as biomarkers for multi-cancer diagnosis and monitoring. Clin Transl Med. 2023;13(9):e1393.
[3] Wang Y, Wang M, Zhang Y. Purification, full-length sequencing and genomic origin mapping of eccDNA. Nat Protoc. 2023;18(3):683-699.
[4] Yang F, Su W, Chung OW, et al. Retrotransposons hijack alt-EJ for DNA replication and eccDNA biogenesis. Nature. 2023;620(7972):218-225.

2021年12月，齊碳科技通過5年的自主研發(fā)，成功推出國(guó)內(nèi)首臺(tái)商業(yè)化的納米孔基因測(cè)序儀QNome-3841，并宣布首個(gè)生產(chǎn)基地竣工，正式開啟納米孔基因測(cè)序國(guó)產(chǎn)化時(shí)代。2022年6月，齊碳科技發(fā)布納米孔基因測(cè)序儀QNome-3841hex，標(biāo)志著國(guó)產(chǎn)納米孔基因測(cè)序儀開始了矩陣化發(fā)展，這也為靈活測(cè)序場(chǎng)景提供全新的解決方案，將更好地滿足市場(chǎng)應(yīng)用的多元需求。
 
2023年8月，齊碳隆重推出自主研發(fā)的中通量納米孔基因測(cè)序平臺(tái)QPursue，該平臺(tái)涵蓋納米孔基因測(cè)序儀QPursue-6k和QPursue-6khex及其配套芯片QCell-6k，代表著國(guó)內(nèi)納米孔基因測(cè)序技術(shù)的最前沿水平，標(biāo)志著國(guó)產(chǎn)納米孔基因測(cè)序儀向中高通量進(jìn)階。