細(xì)胞外囊泡和外泌體的流式檢測(cè)方法已經(jīng)逐漸流行起來(lái)，因?yàn)榱魇郊?xì)胞儀不僅可以檢測(cè)囊泡的大小、數(shù)量，而且通過(guò)細(xì)胞特異的標(biāo)記物染色可以檢測(cè)囊泡的來(lái)源，將囊泡進(jìn)行分類，因此，流式細(xì)胞儀理論上是進(jìn)行囊泡快速、高通量、多參數(shù)檢測(cè)的最優(yōu)選擇。

 

利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞外囊泡檢測(cè)往往需要使用標(biāo)準(zhǔn)微球（microspheres）來(lái)校正和設(shè)門（SetGate），常用的微球材料有聚苯乙（）烯（Polystyrene）和二氧化硅（silica），國(guó)際血栓與止血協(xié)會(huì)和標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ISTH SSC）推薦用于循環(huán)微粒（微囊泡）檢測(cè)設(shè)門的Megamix就是聚苯乙（）烯微球。但是，最近越來(lái)越多的研究人員發(fā)現(xiàn)，用標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行設(shè)門存在很嚴(yán)重的偏差，因?yàn)椴煌�材料的微球的折射率（refractive index）是不一樣的，相同直徑的微球，折射率越大產(chǎn)生的散射光就越強(qiáng)。而且微球的折射率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于生物囊泡的折射率，意味著微球產(chǎn)生的散射光強(qiáng)度是相同直徑囊泡的幾十倍。實(shí)際上，0.5mm聚苯乙（）烯微球（Megamix）產(chǎn)生的散射光強(qiáng)度相當(dāng)于1.4mm的囊泡，而2.7mm的囊泡才能產(chǎn)生跟0.9mm聚苯乙（）烯微球（Megamix）相當(dāng)強(qiáng)度的散射光（表1）[1]。因此，如果我們用0.5mm的聚苯乙（）烯微球（Megamix）設(shè)門來(lái)檢測(cè)小于0.5mm的細(xì)胞外囊泡將產(chǎn)生嚴(yán)重的偏差，檢測(cè)結(jié)果也是不可信的。而二氧化硅的折射率更接近于生物囊泡的折射率，因此二氧化硅微珠可以作為較好的參考粒子。

 

*FSRI, forward scatter relative intensity measured on the Apogee A40. **Diameter of a lipid or cellular microparticle with the same forward scatter relative intensity as the particle that was measured. Equivalent microparticle diameter (mm) = 3.2911(PD) - 0.2768, where PD = polystyrene microsphere diameter (mm).

 

英國(guó)Apogee Flow公司的ApogeeMix (Cat #1493)標(biāo)準(zhǔn)微球是一種非常成熟易用的混合標(biāo)準(zhǔn)微球：包括熒光標(biāo)記的乳膠微球和無(wú)熒光標(biāo)記的二氧化硅標(biāo)準(zhǔn)微球，粒徑范圍涵蓋110nm到1300nm之間不同大小的標(biāo)準(zhǔn)微球。這種混合標(biāo)準(zhǔn)微球不僅可提供簡(jiǎn)便的方法來(lái)評(píng)估流式細(xì)胞儀散射光和熒光的靈敏度及分辨率，同時(shí)，內(nèi)含多種不同大小的納米級(jí)二氧化硅標(biāo)準(zhǔn)微球，更是可以更接近生物樣品折射率的折射率（1.43）對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行散射光校準(zhǔn)，現(xiàn)已成為微小生物納米顆粒流式分析的金標(biāo)準(zhǔn)參考微球。

 

ApogeeMix標(biāo)準(zhǔn)微球組成：

25ml的混合標(biāo)準(zhǔn)微球溶液，內(nèi)含折射率ɳ=1.43，直徑分別為180nm、240nm、300nm、590nm、880nm和1300nm的二氧化硅標(biāo)準(zhǔn)微球，以及折射率ɳ=1.59，直徑分別為110nm和500nm的488激光激發(fā)的綠色熒光標(biāo)記乳膠微球。該產(chǎn)品可以很好地用于評(píng)估流式細(xì)胞儀散射光和熒光的分析性能（靈敏度和分辨率）。下圖1是在Apogee A50-Micro流式細(xì)胞儀上分析的ApogeeMix典型數(shù)據(jù)（FL1=綠色熒光）。

 

綠色熒光標(biāo)記的乳膠微球可用于評(píng)估流式細(xì)胞儀熒光靈敏度和不同折射率背景下的光學(xué)分析性能。

圖1：不同大小標(biāo)準(zhǔn)微球在峰形圖中的分辨率可很好地展現(xiàn)流式細(xì)胞儀的分析性能。理想情況下，8種不同大小的標(biāo)準(zhǔn)微球峰形群應(yīng)相互分離，并可與儀器噪聲明顯區(qū)分開：

6種大小，折射率為1.43的二氧化硅微球和2種大�。�110nm和500nm），折射率為1.59的綠色熒光乳膠微球（488nm激光激發(fā)）（中間圖）。

 

為了更精確地檢測(cè)生物囊泡大�。ㄕ凵渎释ǔＴ�1.36到1.40之間），英國(guó)Apogee納米流式細(xì)胞儀的工程師們研發(fā)了專利的折射率校正功能，無(wú)論是單參數(shù)的柱狀圖（Histogram）還是雙參數(shù)的散點(diǎn)圖（Cytogram），只要單擊右鍵選擇“Choose Calibration Scale”就會(huì)出現(xiàn)一條校正大小的標(biāo)尺，并且可以根據(jù)檢測(cè)樣本的折射率來(lái)選擇相應(yīng)折射率的標(biāo)尺（圖2），那么我們就可以根據(jù)樣本的直徑大小和折射率這兩個(gè)參數(shù)來(lái)設(shè)門和選擇我們感興趣的區(qū)域（region of interest, ROI），得到真實(shí)可靠的結(jié)果。

圖2.折射率分別為1.38和1.42的微粒（180, 240,300 ,590, 880, 1300, 2000nm）在散點(diǎn)圖中的位置。

 

那么市面上的流式細(xì)胞儀是否都適合進(jìn)行細(xì)胞外囊泡和外泌體的檢測(cè)？

 

首先，細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）直徑從40nm到1000nm不等，胞外囊泡直徑約為100nm–1000nm，外泌體直徑約為40nm - 100nm。對(duì)傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀來(lái)說(shuō)，散射光的檢測(cè)極限通常是300-500nm，無(wú)法將大多數(shù)細(xì)胞外囊泡與背景噪音區(qū)分，直徑小于300nm的細(xì)胞外囊泡很難被檢測(cè)到[2]。

 

其次，我們來(lái)看一組流式細(xì)胞儀散射光技術(shù)對(duì)比：

圖 3. Technological improvement in forward scatter (FS) for microparticle (MP) measurement: (A) Beads resolution improvement: FS distribution of a blend of fluorescent latex beads (0.1/0.14, 0.3, 0.5 and 0.9 μm) with a threshold on fluorescence. (B) Background noise reduction: Scatters dot plot showing blue (0.9 μm beads), red (0.5 μm beads), green (0.3 μm beads) and violet (0.1/0.14 μm beads) beads with a FS threshold. Grey dots are background noise.

 

圖3展示的是Apogee納米流式細(xì)胞儀A50-Micro與其它流式細(xì)胞儀（F50、Gallios、Influx）的技術(shù)對(duì)比[2]，通過(guò)前向角散射光FC500只能勉強(qiáng)區(qū)分0.5μm和0.9μm的微珠，0.5μm以下的微珠則完全無(wú)法區(qū)分；Gallios和Influx在散射光檢測(cè)能力方面有所提高，可以區(qū)分0.3μm和0.5μm的微珠，但0.3μm以下的微珠還是無(wú)法區(qū)分；而Apogee A50-Micro可以輕松地將0.14μm的微珠和0.3μm的微珠分成兩個(gè)群（Fig 1.A）。從前向角散射光和側(cè)向角散射光的散點(diǎn)圖中可以看到，無(wú)論是FC500還是Gallios或Influx都只能部分的將0.3μm的微珠與背景噪音區(qū)分開，而A50-Micro可以清晰地將0.3μm的微珠與背景噪音完全區(qū)分開（Fig1.B中綠色數(shù)據(jù)點(diǎn)），并且只有A50-Micro可以檢測(cè)到0.14μm的微珠（Fig1.B中紫色數(shù)據(jù)點(diǎn)）。

 

這些結(jié)果充分說(shuō)明Apogee納米流式細(xì)胞儀在檢測(cè)微小顆粒的優(yōu)越性。利用Apogee A50-Micro突出的高靈敏度和分辨率（10nm），我們可以輕松地將直徑相差10nm以上的細(xì)胞外囊泡樣本進(jìn)行分群、計(jì)數(shù)、分析。另外，多達(dá)9通道熒光檢測(cè)器，可以靈活使用細(xì)胞外囊泡特定抗原熒光抗體進(jìn)行快速、高通量、多參數(shù)檢測(cè)囊泡來(lái)源和精確數(shù)量分析。

 

另外，由于外泌體（exosomes）的直徑特別�。�40 - 100nm），超出了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍，為此，很多公司提供了特異抗體標(biāo)記的微珠用于外泌體的富集和流式分析，但這種方法的局限是操作復(fù)雜，對(duì)抗體特異性要求很高，而且無(wú)法知道外泌體的數(shù)量。而Apogee納米流式細(xì)胞儀超高的靈敏度和分辨率使其可以直接對(duì)樣本中的外泌體進(jìn)行分析和計(jì)數(shù)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確。美國(guó)個(gè)性化醫(yī)療的領(lǐng)軍生物技術(shù)公司Caris Life Sciences正是利用A50-Micro來(lái)檢測(cè)和分析復(fù)雜病人樣本中的微囊泡和外泌體[3]。

 

如果沒(méi)有Apogee納米流式細(xì)胞儀，不妨先選擇試試ApogeeMix標(biāo)準(zhǔn)微球，讓你的外泌體流式分析結(jié)果更準(zhǔn)確！

 

[1] Chandler WL, Yeung W, Tait JF. A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer. J Thromb Haemost. 2011 Jun;9(6):1216-24.

[2] Lacroix R, Robert S, Poncelet P, Dignat-George F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Semin Thromb Hemost. 2010 Nov;36(8):807-18.

[3] Abstracts from the Third International Meeting of ISEV 2014. Rotterdam, The Netherlands, April 30th – May 3rd, 2014. J Extracell Vesicles. 2014; 3:24214.

 

 

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