本文要點(diǎn)：高質(zhì)量的近紅外二區(qū)（NIR-II）納米探針可用于檢測(cè)疾病、監(jiān)測(cè)治療過(guò)程和了解疾病發(fā)展，對(duì)實(shí)時(shí)生物成像和醫(yī)學(xué)診斷具有重要意義。菁是構(gòu)建可激活探針的一類重要熒光團(tuán)，基于菁的NIR-II熒光團(tuán)往往具有優(yōu)異的光學(xué)性能、簡(jiǎn)單的合成方法和極高的吸收，然而其生物學(xué)應(yīng)用卻受到包括水溶液中呈弱熒光、穩(wěn)定性差和特異性不足等缺點(diǎn)的阻礙。

本文采用分子工程開(kāi)發(fā)了具有明亮、穩(wěn)定發(fā)射和高特異性的基于菁的可激活NIR-II納米平臺(tái)。采用聚（苯乙烯-馬來(lái)酸酐）（PSMA）封裝NIR-II熒光分子IR1048，以獲得穩(wěn)定明亮的NIR-II納米顆粒（PSMA@IR1048 NP）。通過(guò)電荷調(diào)制策略，將一系列菁熒光團(tuán)負(fù)載在PSMA@IR1048 NP上，對(duì)活性物質(zhì)表現(xiàn)出可調(diào)響應(yīng)。結(jié)合兩種策略，構(gòu)建了NIR-II比率型熒光納米探針RNP，包括RNP1、RNP2和RNP3；其中，RNP2表現(xiàn)出次氯酸（HClO）響應(yīng)性能，并產(chǎn)生更高的NIR-II熒光比（FL2/FL1）信號(hào)。這種納米探針能夠可靠地報(bào)告糖尿病肝損傷和下肢缺血再灌注（I/R）損傷小鼠模型中的病理性HClO水平。為構(gòu)建用于生物成像的穩(wěn)定、明亮和特異的基于菁的NIR-II探針提供了策略。

 

 

---

作者首先將IR780和IR1048作為納米顆粒核心的備選分子，選用了一系列兩親性多聚物來(lái)封裝IR780（圖1a）和IR1048（圖1e），以改善它們?cè)贖2O中的光學(xué)性質(zhì)和對(duì)HClO的化學(xué)穩(wěn)定性。其中，PSMA@IR780 NP在加入HClO后780nm處的吸光度沒(méi)有顯著變化，顯示出較好的穩(wěn)定性（圖1b, c），這可能歸因于其相對(duì)較低的ζ電位（圖1d），導(dǎo)致納米顆粒和HClO間產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電排斥。在多聚物結(jié)合IR1048所得的納米顆粒中，DSPE-PEG@IR1048 NP和PSMA@IR1048 NP的吸收光譜具有1048nm的特征峰，證實(shí)IR1048可以成功地結(jié)合到DSPE-PEG和PSMA中，而其余納米顆粒在1048nm處的吸光度可忽略不計(jì)（圖1f）。調(diào)整IR1048 NP中PSMA和DSPE-PEG的比例，發(fā)現(xiàn)隨著PSMA的百分比從0%增加到100%，在H2O中其NIR-II熒光強(qiáng)度逐漸增加（圖1g），對(duì)HClO的穩(wěn)定性也不斷增加（圖1h），ζ電位逐漸降低（圖1i）。這表明PSMA可以提高IR1048在水溶液中的熒光強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性。因此，選擇PSMA@IR1048NP進(jìn)行表征和后續(xù)成像實(shí)驗(yàn)。

PSMA@IR1048 NP可以很好地分散在水中，在透射電子顯微鏡下呈直徑約30nm的球形（圖1j）。在水中顯示出明亮穩(wěn)定的NIR-II熒光，強(qiáng)度高于H2O或MeOH中的游離IR1048染料（圖1k）。在與不同活性物質(zhì)孵育后，其吸光度和熒光沒(méi)有明顯變化，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性（圖1l, m）。

圖1.（a）兩親性聚合物和IR780的化學(xué)結(jié)構(gòu)。兩親性聚合物@IR780 NPs的一步自組裝。游離染料IR780和用不同兩親性聚合物修飾的IR780在與HClO孵育之前（b）和之后（c）的吸收光譜。（d）用不同兩親性聚合物修飾的IR780的ζ電位。（e）兩親性聚合物@IR1048 NPs的一步自組裝。（f）不同兩親性聚合物修飾的IR1048的吸收光譜。（g）不同PSMA和DSPE-PEG比例的兩親性聚合物@IR1048 NPs的熒光強(qiáng)度。插圖：納米顆粒相應(yīng)的熒光圖像。（h）不同PSMA和DSPE-PEG比例的兩親性聚合物@IR1048 NPs在與HClO孵育前后的1048nm處的吸光度。（i）用不同比例的PSMA和DSPE-PEG修飾的IR1048的ζ電位。（j）PSMA@IR1048 NPs在H2O中的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。（k）IR1048在H2O、MeOH中和PSMA@IR1048 NPs在H2O中的NIR-II（1100-1700 nm）熒光對(duì)比。PSMA@IR1048 NPs在PBS中與各種活性物質(zhì)孵育后的的吸收（l）和熒光（m）光譜。1：PBS；2：1O2（50μmol/L）；3：Cys（50μmol/L）；4：GSH（50μmol/L）；5：H2O2（50μmol/L）；6：·O2−（50μmol/L）；7：·OH（50μmol/L）；8：ONOO−（20μmol/L）；9：HClO（20μmol/L）。激發(fā)波長(zhǎng)：980nm。

 

接下來(lái)，將一系列菁基熒光團(tuán)負(fù)載在PSMA@IR1048 NP上，構(gòu)建比率型NIR-II探針RNP（圖2a, e, i）。相較于游離菁基染料，RNP由于其在水溶液中的溶解度得到改善，表現(xiàn)出更明顯的氰基熒光團(tuán)特征吸收峰（780nm）和強(qiáng)熒光發(fā)射（820nm）（圖2b, f, j）。RNP的化學(xué)穩(wěn)定性與所負(fù)載的菁基染料的電荷有關(guān)。攜帶+1凈電荷的IR780分子靜電吸附增強(qiáng)，從而顯著提高其化學(xué)穩(wěn)定性，加入活性物質(zhì)后吸光度和熒光幾乎恒定。而IR775S和IR796帶有0和−1的凈電荷，靜電吸附減弱，使它們更容易被活性物質(zhì)破壞（圖2c, g, k）。值得注意的是，RNP2在加入HClO后吸光度急劇下降，而對(duì)其他活性物質(zhì)有較好的穩(wěn)定性，這成為構(gòu)建比率型熒光納米探針的基礎(chǔ)。此外，RNP的光穩(wěn)定性也得到改善（圖2d、h、l）。

圖2. NIR-II比率熒光納米探針RNP1（a）、RNP2（e）、RNP3（i）的構(gòu)建。（b）IR780和RNP1在H2O中的熒光光譜。（f）IR775S和RNP2在H2O中的熒光光譜。（j）IR796和RNP3在H2O中的熒光光譜。RNP1（c）、RNP2（g）、RNP3（k）與各種活性物質(zhì)孵育后的吸收光譜。RNP1（d）、RNP2（h）、RNP3（l）在808nm激光（180s，200mW/cm2）下的吸收光譜。

 

如圖3a，RNP2表面的IR775S在HClO存在時(shí)顯示出“關(guān)閉”NIR-II熒光（FL1，激發(fā)波長(zhǎng)808nm），同時(shí)核心中的IR1048對(duì)HClO足夠穩(wěn)定，因此提供了穩(wěn)定的NIR-II輸出信號(hào)（FL2，激發(fā)波長(zhǎng)980nm）。RNP2在水溶液中分散性良好，呈球形（~30nm）（圖3b）。

接著調(diào)節(jié)HClO濃度驗(yàn)證RNP2對(duì)HClO的響應(yīng)特性。檢測(cè)吸收光譜發(fā)現(xiàn)，隨HClO濃度從0增加到20μmol/L，RNP2在約780nm處的吸光度逐漸降低，而IR1048特征吸收峰的變化可忽略（圖3c）。熒光光譜也顯示，IR775S的特征峰（~820nm）隨HClO的濃度增加不斷降低，而IR1048峰無(wú)顯著變化（圖3e, f）。將FL2熒光圖像除以FL1圖像來(lái)進(jìn)一步構(gòu)造比率圖像（FL2/FL1），發(fā)現(xiàn)RNP2的FL2/FL1比率隨HClO濃度的升高而逐漸增加（圖3d, g）。相較于其他活性物質(zhì)，在HClO存在時(shí)的FL2/FL1比例提高了約30倍，表明RNP2對(duì)HClO具有優(yōu)異的特異性（圖3h, i）。

圖3.（a）用于HClO比率熒光成像的RNP2方案。（b）RNP2的代表性TEM圖像。（c）RNP2與0–20μmol/L HClO孵育后的吸收光譜。（d）在與不同濃度的HClO孵育后，RNP2的FL1（激發(fā)波長(zhǎng)：808nm，發(fā)射波長(zhǎng)：1100-1700nm）、FL2（激發(fā)波長(zhǎng)：980nm，發(fā)射波長(zhǎng)：1100-1700nm）和FL2/FL1的熒光圖像。（e）RNP2與不同濃度的HClO孵育后的熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)：740和980nm。（f）RNP2在820nm處的熒光與（e）中的HClO濃度之間的線性關(guān)系。（g）在用（e）中不同濃度的HClO孵育后RNP2的FL2/FL1的定量。（h）選擇性反應(yīng)：與不同活性物質(zhì)孵育后，RNP2的FL1、FL2和FL2/FL1的熒光圖像。1：PBS；2：1O2（50μmol/L）；3：Cys（50μmol/L）；4：GSH（50μmol/L）；5：H2O2（50μmol/L）；6：·O2−（50μmol/L）；7：·OH（50μmol/L）；8：ONOO−（20μmol/L）；9：HClO（20μmol/L）。激發(fā)波長(zhǎng)：808和980 nm，發(fā)射：1100–1700 nm。（i）與不同活性物質(zhì)孵育后RNP2的歸一化FL2/FL1比率。

 

糖尿病是一種以血糖水平升高為特征的代謝紊亂。在高血糖狀態(tài)下，肝臟葡萄糖異常升高，其氧化磷酸化會(huì)導(dǎo)致ROS過(guò)度產(chǎn)生，而ROS在糖尿病的進(jìn)展和發(fā)展中起到重要的作用。因此，實(shí)時(shí)檢測(cè)HClO水平對(duì)于糖尿病的輔助診斷非常重要。受RNP2對(duì)HClO具有良好選擇性的啟發(fā)，作者進(jìn)一步使用RNP2對(duì)糖尿病小鼠的HClO水平進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。

注射生理鹽水的小鼠為健康小鼠（第1組）；腹膜內(nèi)注射鏈脲佐菌素以獲得糖尿病小鼠（2-4組）；用二甲雙胍治療糖尿病小鼠，以緩解糖尿病期間的氧化應(yīng)激（第5組）。（圖4a）�？梢�(jiàn)第2-4組的小鼠體重逐漸下降（圖4b），其中第4組的血糖水平顯著升高（圖4c）。熒光成像結(jié)果顯示，第1、5組顯示出強(qiáng)烈的FL1熒光，而第2-4組FL1的熒光強(qiáng)度逐漸降低（圖4d, e）。且從第1組到第4組，F(xiàn)L2/FL1的比率顯著增加（圖4f），表明隨著糖尿病的持續(xù)進(jìn)展，HClO水平升高。結(jié)合檢測(cè)時(shí)間可知，基于RNP2的比率熒光成像能夠比體重變化早至少1天檢測(cè)出鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病，比血糖測(cè)定早至少6天檢測(cè)出糖尿病。

作者還研究了糖尿病與肝損傷之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)糖尿病過(guò)程導(dǎo)致血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）顯著增強(qiáng)（圖4g, h）。肝臟組織學(xué)分析結(jié)果也顯示，與健康小鼠和治療組相比，在不同進(jìn)展的糖尿病小鼠中觀察到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和空泡變性，并且晚期糖尿病小鼠的損傷比早期糖尿病小鼠更嚴(yán)重（圖4i），證明肝損傷與糖尿病之間存在積極關(guān)系。

圖4.（a）RNP2用于糖尿病小鼠成像和給藥程序的方案。（b）糖尿病小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)體重。（c）1-4組小鼠的血糖濃度（ns：無(wú)顯著差異，****：P<0.0001，ANOVA）。當(dāng)平均血糖濃度被確定為大于11.1mmol/L時(shí)，認(rèn)為小鼠中已經(jīng)發(fā)生糖尿病。（d）靜脈注射RNP2 10分鐘后，1-5組小鼠的FL1、FL2和比率FL2/FL1圖像。FL1激發(fā)波長(zhǎng)：808 nm，F(xiàn)L2激發(fā)波長(zhǎng)：980 nm。發(fā)射波長(zhǎng)：1100-1700 nm。黃色曲線表示肝臟區(qū)域。（e, f）靜脈注射RNP2 10分鐘后，第1-5組小鼠的歸一化FL1、FL2和FL2/FL1比率的量化。（g, h）1-5組小鼠的ALT和AST濃度。（i）1-5組小鼠肝臟的代表性H&E染色切片。

 

下肢I(xiàn)/R損傷是骨科手術(shù)中常見(jiàn)的主要并發(fā)癥，通常伴有過(guò)表達(dá)的ROS水平。及時(shí)測(cè)量升高的ROS水平對(duì)檢測(cè)I/R損傷程度具有重要意義。因此將RNP2用于對(duì)I/R損傷模型中的實(shí)時(shí)HClO水平進(jìn)行成像。

小鼠右大腿接受短缺血（30分鐘）或長(zhǎng)缺血（60分鐘），假手術(shù)組（左大腿）作為對(duì)照組，然后均再灌注90分鐘，并腹腔注射RNP2，然后進(jìn)行NIR-II成像（圖5a）。在注射RNP2后0、60和90分鐘，假手術(shù)組的下肢區(qū)域顯示出FL1和FL2強(qiáng)熒光，而缺血組顯示出弱FL1熒光（圖5b-d）。其中，長(zhǎng)缺血組由于HClO量較高且損傷嚴(yán)重，比短缺血組表現(xiàn)出更低的FL1強(qiáng)度和更高的FL2/FL1比率。

此外，對(duì)這些小鼠的下肢切片進(jìn)行了組織學(xué)分析（圖5e）。與假手術(shù)組相比，在I/R損傷區(qū)域可觀察到炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并且長(zhǎng)缺血小鼠（60分鐘）的損傷比短缺血小鼠（30分鐘）的更嚴(yán)重，表明I/R過(guò)程對(duì)小鼠的嚴(yán)重?fù)p傷。

圖5.（a）下肢I(xiàn)/R過(guò)程的代表性程序。（b）靜脈注射RNP2 0、60和90分鐘后短缺血和長(zhǎng)缺血小鼠的FL1、FL2和比率FL2/FL1圖像。發(fā)射波長(zhǎng)：1100-1700 nm。黃色曲線表示假手術(shù)區(qū)域和I/R區(qū)域。（c, d）在注射RNP2 0、60和90分鐘后，短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間缺血小鼠的標(biāo)準(zhǔn)化FL2/FL1比率的量化（平均值±s.d.，*：P<0.05，ANOVA）。（e）短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間缺血小鼠肌肉的代表性H&E染色切片。

 

總之，本研究開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)易的分子工程策略來(lái)構(gòu)建基于菁的NIR-II比率成像納米平臺(tái)，并且成功開(kāi)發(fā)了一種電荷調(diào)制策略，以調(diào)節(jié)納米顆粒對(duì)活性物質(zhì)的反應(yīng)性，賦予其特定的HClO響應(yīng)性能。所制備的RNP2可以避免疾病部位其他活性物質(zhì)的干擾，從而可靠地檢測(cè)HClO的病理水平，顯示了基于菁基的納米探針在特定疾病的NIR-II熒光成像中的良好潛力，該策略可能為設(shè)計(jì)其他明亮穩(wěn)定的NIR-II納米探針及其生物應(yīng)用提供見(jiàn)解。

 

參考文獻(xiàn)

Ma, Y.; Liu, L.; Ye, Z.; Xu, L.; Li, Y.; Liu, S.; Song, G.; Zhang, X.-B., Engineering of cyanine-based nanoplatform with tunable response toward reactive species for ratiometric NIR-II fluorescent imaging in mice. Science Bulletin 2023.

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評(píng)為“國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)”，上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”科學(xué)儀器領(lǐng)域立項(xiàng)單位。

          恒光智影，致力于為生物醫(yī)學(xué)、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供先進(jìn)的、一體化的成像解決方案。

          與基于可見(jiàn)光/近紅外一區(qū)的傳統(tǒng)熒光成像技術(shù)相比，我們的技術(shù)側(cè)重于近紅外二區(qū)范圍并整合CT, X-ray，超聲，光聲成像技術(shù)。

          可為腫瘤藥理、神經(jīng)藥理、心血管藥理、大分子藥代動(dòng)力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫(yī)藥與科學(xué)儀器服務(wù)。