骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞工程化ECM協(xié)同促進(jìn)成骨和血管生成異位骨形成模型

文獻(xiàn)信息

浙江省病理生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院、寧波市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心等團(tuán)隊(duì)合作的研究成果“BMSCs and Osteoblast-Engineered ECM Synergetically Promotes Osteogenesis and Angiogenesis in an Ectopic Bone Formation Model(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞工程化ECM協(xié)同促進(jìn)異位成骨和血管生成)在雜志Frontiers in Bioengineering and Biotechnology(IF:6.064)上發(fā)表。平生公司的離活一體CT(NEMO)在論文中提供了重要的成骨材料圖像和定量分析。

 該研究趙基源教授和李梅副研究員為共同通訊作者，張遲和夏冬冬為共同第一作者。

文獻(xiàn)摘要

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)已廣泛用于骨組織工程，因?yàn)樗鼈兙哂卸喾只�、旁分泌和抗免疫反�?yīng)的潛力。生物材料對(duì)于BMSCs在體內(nèi)植入后的存活和活動(dòng)至關(guān)重要。最近，具有有利骨再生微環(huán)境的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)修飾已被證明是細(xì)胞活動(dòng)和骨再生有效方法。本研究的目的是評(píng)估BMSCs與細(xì)胞工程ECM支架相結(jié)合對(duì)體內(nèi)成骨和血管生成的影響。ECM支架由小腸粘膜下層(SIS)上培養(yǎng)4周的成骨細(xì)胞去細(xì)胞化得到，該成骨細(xì)胞培養(yǎng)期間用富含鈣(Ca)的培養(yǎng)基和淫羊藿苷(Ic)處理。在小鼠異位骨形成模型中，SIS支架被證明可以降低免疫反應(yīng)， 與假手術(shù)組相比，免疫細(xì)胞水平降低。Ca/Ic-ECM修飾抑制了體內(nèi)SIS支架的降解。根據(jù)顯微CT和組織學(xué)染色的結(jié)果，Ca/Ic-SIS支架可異位促進(jìn)成骨。此外，Ca/Ic-SIS上的BMSCs進(jìn)一步增加了骨體積百分比(BV/TV)和骨密度。此外，Ca/Ic-SIS支架也增強(qiáng)了血管生成，根據(jù)CD31染色的數(shù)據(jù)，顯示最高水平的新血管形成。總之，定向誘導(dǎo)下的成骨細(xì)胞工程ECM是一種很有前途的策略，是可以用于成骨和血管生成的生物材料。BMSCs協(xié)同工程化的ECM有助于修復(fù)大缺損骨的修復(fù)。

實(shí)驗(yàn)方法

 

仿生ECM修飾SIS支架的制備

凍干SIS支架SIS支架被切成直徑5毫米的圓形結(jié)構(gòu)，用于通過活檢穿孔器進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。將MC3T3-E1細(xì)胞接種在SIS支架上4周以獲得豐富的ECM。對(duì)于Ca/Ic-SIS制備，CaCl2和淫羊藿苷的濃度按照之前研究中的描述進(jìn)行選擇.簡而言之，在細(xì)胞培養(yǎng)前，將支架在37°C的完全培養(yǎng)基中再水化至少24小時(shí)。將大約5×10⁴MC3T3-E1細(xì)胞滴在SIS支架上。第二天，將帶有細(xì)胞的SIS支架轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，并在常規(guī)培養(yǎng)基或誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有10mM CaCl₂和10μM淫羊藿苷)中培養(yǎng)4周。培養(yǎng)基每隔一天更換一次。如前所述進(jìn)行脫細(xì)胞化。簡而言之，將樣品在-80°C冰箱和37°C水浴中進(jìn)行三個(gè)凍融循環(huán)(每個(gè)步驟30分鐘)。在每個(gè)解凍步驟后，將支架在無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中沖洗以去除細(xì)胞成分。脫細(xì)胞后，生成兩種仿生ECM修飾的SIS，并在使用前儲(chǔ)存在-80°C。

 

小鼠皮下移植后SIS支架的免疫反應(yīng)

體重20-25g的八周齡雄性ICR小鼠用于評(píng)估體內(nèi)植入支架后的免疫反應(yīng)。小鼠隨機(jī)分為四組(Ca/Ic-SIS 組、ECM-SIS組、SIS組和假手術(shù)組)。支架(Φ5mm)通過手術(shù)植入ICR小鼠的皮下部位。在沒有支架植入的情況下接受外科手術(shù)的假手術(shù)組被認(rèn)為是對(duì)照。手術(shù)在全身麻醉下進(jìn)行，麻醉通過腹腔注射1.2%Avertin-PBS溶液(20-25μl/g)。收集來自尾靜脈的血液(20μl)并與1.2ml稀釋劑混合。使用血細(xì)胞分析儀在不同時(shí)間點(diǎn)(1、2、3、5、7、9、11d天)檢測(cè)白細(xì)胞(WBCs)、單核細(xì)胞(MONs)和淋巴細(xì)胞(LYMs)的水平、13、15、18、21和24天)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)每組進(jìn)行四次重復(fù)測(cè)定，取平均結(jié)果。

 

SIS支架的體內(nèi)降解試驗(yàn)

支架(Φ5mm)分為以下六組:SIS、ECM-SIS、Ca/Ic-SIS、SIS+BMSCs、ECM-SIS+BMSCs和Ca/Ic-SIS+BMSCs，每組四只動(dòng)物。所有組均通過手術(shù)單獨(dú)植入ICR小鼠的皮下部位。8周后通過大體觀察檢測(cè)到體內(nèi)支架的降解。

 

Ca/Ic-SIS支架與BMSCs對(duì)異位成骨的影響

小鼠皮下移植模型用于評(píng)估由Ca/Ic ECM修飾的SIS支架誘導(dǎo)的異位成骨和血管形成。動(dòng)物隨機(jī)分為以下六個(gè)治療組(Φ5mm，n=4):SIS、ECM-SIS、Ca/Ic-SIS、SIS+ BMSCs、ECM-SIS+BMSCs和Ca/Ic-SIS+BMSCs。在用BMSC處理的組中，將1×10⁵細(xì)胞接種在浸泡在普通培養(yǎng)基中的SIS、ECM-SIS或Ca/Ic-SIS支架上。37°C孵育12小時(shí)以允許細(xì)胞附著，然后將細(xì)胞/支架復(fù)合材料通過手術(shù)植入ICR小鼠的雙側(cè)皮下。手術(shù)在全身麻醉下進(jìn)行，麻醉通過腹腔注射1.2%Avertin-PBS溶液(20-25μl/g)。手術(shù)后8周處死所有動(dòng)物。

 

顯微CT分析

8周后，使用顯微CT掃描儀(NEMO Micro CT；平生醫(yī)療科技有限公司)對(duì)植入物進(jìn)行成像和評(píng)估。標(biāo)本的掃描CT圖像使用90kV和60μA獲取，并使用計(jì)算機(jī)軟件(Recon；平生醫(yī)療科技有限公司)進(jìn)行三維(3D)重建。比較各組缺損部位再生骨量、骨密度、感興趣區(qū)(ROI)組織密度。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Ca/Ic ECM修飾促進(jìn)異位骨形成

顯微CT用于分析植入基于SIS的支架后8周的異位骨形成。最初，在手術(shù)前后對(duì)帶有支架的整個(gè)組織進(jìn)行了評(píng)估。如圖所示圖 3A、B, ECM-SIS和Ca/Ic-SIS支架的密度(A)和體積(B)明顯高于移植前的原始SIS支架。體內(nèi)8周后，Ca/Ic-SIS支架的體積在有或沒有BMSCs的三種植入物中最高，這與圖1中顯示的大體視圖一致圖2。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，Ca/Ic修飾能夠減緩體內(nèi)SIS支架的降解。BMSCs進(jìn)一步增加了植入后Ca/Ic-SIS的密度，說明BMSCs可促進(jìn)Ca/Ic-SIS植入后體內(nèi)細(xì)胞的募集和黏附(圖3A)然后，BV/TV和骨體積用于評(píng)估再生骨的數(shù)量，骨密度用于評(píng)估再生骨的質(zhì)量(圖3C–F).結(jié)果顯示在原始SIS組中，異位骨模型中無論有無BMSCs移植均未檢測(cè)到新骨(圖3C)，而無論是否存在BMSC，ECM修飾的SIS組(ECM-SIS和Ca/Ic-SIS)中新生骨都很明顯(圖3C)。此外，根據(jù) BV/TV 評(píng)估和骨體積測(cè)量值，使用Ca/IcSIS植入物的組新骨形成水平高于其他組(圖3D)(圖3F)，BMSCs的加入進(jìn)一步增加了Ca/IcSIS植入物的BV/TV(圖3D)和骨密度(圖3E)。

小鼠皮下植入8周后ECM-SIS和Ca/Ic-SIS誘導(dǎo)異位骨形成的顯微CT評(píng)價(jià)(含或不含BMSCs)。Micro CT分析植入前后支架的密度(A)和體積(B)。(C)植入后8周具有代表性的三維重建顯微ct圖像�；�于三維重建圖像計(jì)算各組新骨形成率(D)、再生骨密度(E)和感興趣區(qū)域骨體積(F)。(n=3).*,p < 0.05， **，p < 0.01， ***，p < 0.001。

 

文獻(xiàn)結(jié)論

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了組織工程骨模擬支架(Ca/Ic-SIS)在異位成骨模型中的多種潛在影響，包括免疫反應(yīng)、支架降解、異位骨形成和血管生成。作為天然ECM生物材料，經(jīng)過或未經(jīng)過成骨ECM修飾的SIS支架均表現(xiàn)出低免疫原性和手術(shù)早期引起的免疫反應(yīng)降低。成骨ECM修飾延遲了SIS支架的降解，尤其是當(dāng)支架被Ca/Ic-ECM修飾時(shí)。此外，兩種成骨ECM修飾的SIS(ECM-SIS和Ca/Ic-SIS)被證明可以促進(jìn)異位骨形成，并且BMSCs的摻入進(jìn)一步促進(jìn)了Ca/Ic-SIS組的新骨形成。Ca/Ic-SIS支架表現(xiàn)出最優(yōu)的促血管生成作用，尤其是在摻入BMSC之后。這些數(shù)據(jù)和作者之前的研究結(jié)果表明，在特定條件下的成骨ECM修飾是提高骨組織工程中支架材料性能的有效策略，并可通過協(xié)同BMSCs加速組織修復(fù)。

 

使用設(shè)備

                                  Micro CT（型號(hào)：NEMO）（平生醫(yī)療科技）

                                          影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）