Izon qEV尺寸排阻柱在癌癥診斷及開發(fā)中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：810　發(fā)布日期：2023-9-7　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

簡介：對于用于癌癥診斷的EV分離純化，選擇正確的方法可能是找到成功的診斷標(biāo)記物與未能達(dá)到足夠的特異性和敏感性之間的區(qū)別。隨著qEV尺寸排阻柱提供卓越的EV純度，您的生物標(biāo)志物有更大的機會在背景噪聲中脫穎而出。

隨著人口增長和老齡化，癌癥死亡率也在增加。好消息是，自1990年以來，經(jīng)過年齡標(biāo)準(zhǔn)化的癌癥死亡率實際上有所下降，盡管截至2019年只下降了15.22％（圖1）。在此期間出現(xiàn)了數(shù)百種新的癌癥治療方法，但為什么存活率仍令人失望呢？正如世界衛(wèi)生組織所說，早期診斷可以挽救生命并降低治療成本。篩查的關(guān)鍵是非侵入性、可靠、可擴(kuò)展的檢測方法，可以在病理發(fā)生的早期階段檢測到癌癥，以便進(jìn)行快速治療。最近的研究表明，可能有一個答案：細(xì)胞外囊泡（EVs）。這些微小的蛋白質(zhì)、核酸和小分子的包裹物可被所有細(xì)胞（包括癌細(xì)胞）釋放到體液中。

近年來，對EV作為癌癥診斷的興趣呈指數(shù)增長，2022年發(fā)表在這個主題上的文章數(shù)量比2011年多150倍（來源：Web of Science）。考慮到EV具有將癌細(xì)胞衍生的蛋白質(zhì)、RNA甚至DNA運輸?shù)揭子诜乔秩胄栽\斷的生物液體的潛力，該領(lǐng)域的診斷潛力是巨大的。然而，這些診斷測試開發(fā)中使用的許多方法不夠純凈，可能無法擴(kuò)展到診斷，更不用說大型篩查項目了。在本文中，我們將看一下EV癌癥診斷領(lǐng)域內(nèi)的三篇論文，每篇比較不同的EV分離純化方法。

圖1. 全球癌癥死亡率變化。數(shù)據(jù)來自IHME Global Burden of Disease。死亡率的增加可能是由于全球人口的增加，而未經(jīng)年齡標(biāo)準(zhǔn)化的癌癥死亡率的增加可能是由于全球人口的老齡化。年齡標(biāo)準(zhǔn)化癌癥死亡率的降低可能代表了診斷和治療的改進(jìn)。

這三項比較EV分離純化方法用于癌癥診斷的研究之一是由Pang等人（2020）[1] 進(jìn)行的，該研究來自前列腺癌診斷領(lǐng)域，目前的黃金診斷標(biāo)準(zhǔn)前列腺特異性抗原導(dǎo)致了許多不必要的活檢 [2]。在Pang等人的研究中，他們旨在確定前列腺來源的血漿EV是否可以攜帶更具體的生物標(biāo)志物。

第二項研究是由Northrop-Albrecht等人（2022）[3]進(jìn)行的，他們轉(zhuǎn)向人類大便上清液EV診斷結(jié)腸癌。早期診斷結(jié)腸癌尤為重要，因為較晚的診斷將局部癌癥的91％ 5年生存率降至僅為13％的遠(yuǎn)處擴(kuò)散癌癥的生存率。

最后，Anastasi等人的研究（2020）[4]研究了一種多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的小鼠模型，希望完善血清EV分離純化技術(shù)，以便識別疾病進(jìn)展的縱向標(biāo)志物。

比較的EV分離方法背后的原理

每項研究中比較的EV分離方法原理如圖2所示。

圖2. 每個研究比較的細(xì)胞外囊泡（EV）純化方法。

沉淀法利用聚合物（例如聚乙二醇，�？s寫為PEG）的聚合作用形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，較大的顆粒物和許多較小的顆粒物會被困住。然后可以將此網(wǎng)狀物離心到管底。雖然此過程與特異性捕獲EV無關(guān)，但經(jīng)常被使用。

qEV尺寸排阻柱使用尺寸排除色譜法根據(jù)其顆粒大小將EV與其他顆粒物分離。qEV有各種尺寸，可基于相同的原理分離從150 µL到100 mL的樣品。qEV有兩個系列：35 nm和70 nm系列，分別分離略有不同的EV范圍。

超濾將EV和任何其他較大的分子從起始樣品濃縮到較小的體積中，與沉淀一樣，不能真正單獨分離EV。

超速離心是EV領(lǐng)域的黃金標(biāo)準(zhǔn)。它使用逐漸增加的離心力將不同大小的顆粒沉淀，EV通常在或高于100,000 x g的離心下沉。雖然被認(rèn)為是黃金標(biāo)準(zhǔn)，但由于純度低、加工時間長以及EV受離心力損傷等問題，這種技術(shù)越來越不受青睞。

那么，在癌癥診斷的背景下，這些方法如何比較呢？

這些方法中，qEV可以分離出更純的EVs

非EV組分的污染會覆蓋真正的癌癥EV生物標(biāo)志物的信號，阻礙生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、驗證和關(guān)鍵的早期診斷。對于與EV相關(guān)的蛋白生物標(biāo)志物，這意味著必須去除可溶性蛋白和脂蛋白。而對于EV-RNA生物標(biāo)志物，非EV RNA去除是關(guān)鍵。

qEV擅長去除蛋白質(zhì)污染

EV分離物中可溶性蛋白質(zhì)的污染程度通常由EV與蛋白質(zhì)濃度的比率顯示。Pang等人和Anastasi等人發(fā)現(xiàn)，與血漿和血清沉淀法相比，qEV的分離物具有更高的EV/蛋白質(zhì)比率（圖3A和C）。qEV 70nm略優(yōu)于qEV 35nm，這是有道理的，因為35nm的尺寸截留較小，意味著可能會共同分離一些較大的蛋白復(fù)合物。Northrop-Albrecht等人發(fā)現(xiàn)，在糞便上清樣品中，超速離心可能比其他技術(shù)提供略高的純度，盡管超速離心的純度變化非常大（圖3B）。

圖3. 使用不同方法分離出的細(xì)胞外囊泡（EVs）的純度。

A和D：Pang等人通過商業(yè)沉淀試劑盒或qEV 35 nm或qEV 70 nm從前列腺癌患者或健康對照組的血漿中分離出EVs，確定了在蛋白質(zhì)污染（A；EV標(biāo)記物CD81、CD9和CD63相對強度除以分離物中的蛋白質(zhì)µg）和脂蛋白污染（D；分離物中的ApoB強度）方面的純度。統(tǒng)計分析采用One-way ANOVA 和 unspecified post-hoc test。

B和E：Northrop-Albrecht等人分析了用于結(jié)直腸癌診斷的人類大便中用不同方法分離出的EVs的純度（以蛋白質(zhì)污染（B；每µg蛋白質(zhì)的顆粒數(shù)）和RNA污染（E；經(jīng)蛋白酶K和RNase A處理后分離物中非EV RNA的降解）來表示）。UF=超濾；UC=超速離心；20k=20,000 x g沉淀；100k=100,000 x g沉淀。沉淀A和B代表兩種不同的商業(yè)沉淀試劑盒。統(tǒng)計分析采用Kruskal-Wallis檢驗。

C和F：Anastasi等人通過商業(yè)沉淀試劑盒或qEV 70 nm從小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中分離出的EVs，確定了分離物中蛋白質(zhì)去除百分比（C；通過分離物中的蛋白質(zhì)濃度除以起始材料中的5,000 µg/µL計算）和污染物或“外泌體”蛋白質(zhì)的相對富集（F；DAVID富集分析）。統(tǒng)計分析采用成對T檢驗（C）或Fisher精確檢驗，采用假陽性發(fā)現(xiàn)率（FDR）多重檢驗校正。

*p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001

qEV可顯著降低脂蛋白污染

由于他們分別使用了血漿和血清，Pang等人和Anastasi等人也對脂蛋白污染感興趣。Pang等人發(fā)現(xiàn)，與沉淀法相比，qEV 70 nm的ApoB污染要低得多。qEV 35 nm顯示出比qEV 70 nm 高的ApoB水平，可能是由于這些柱的較低尺寸截留。Anastasi等人使用蛋白質(zhì)組學(xué)確定，雖然在qEV 70 nm的分離物中沒有富集脂蛋白，但沉淀法分離物中富集了脂蛋白。這些數(shù)據(jù)表明，與常用的沉淀法相比，qEV 70 nm在去除脂蛋白污染方面更為優(yōu)秀。

qEV顯著降低非EV RNA污染在非EV RNA污染方面，qEV 70 nm也表現(xiàn)最佳，經(jīng)過蛋白酶K和RNase A處理以降解非EV RNA后，qEV 70 nm的RNA譜與處理前僅有微小差異（圖3E）。相反，超濾分離物卻會分離出大量非EV RNA，這將掩蓋EV RNA癌癥生物標(biāo)志物的鑒定或測量。

就可規(guī)模化而言，qEV是優(yōu)秀的

要想使診斷測試成功，它必須是可規(guī)�；摹＿@意味著超速離心法因處理時間通常超過每個樣品3小時而被立即排除。這還不包括任何生物標(biāo)志物測量。超速離心法還需要大型、昂貴且（如果使用不當(dāng)）非常危險的設(shè)備。超濾法具有可擴(kuò)展性和自動化的潛力，但僅使用超濾法來分離EV以用于診斷的吸引力受到技術(shù)相對不純的限制（圖2E）。

到目前為止，最快、最簡單的方法是沉淀法，這導(dǎo)致該技術(shù)在診斷研究和試驗中被使用。然而，它對EV的非選擇性非常高，對污染物的去除效果差（圖2A、C、D和F）。使用沉淀法在診斷研究中會阻礙發(fā)現(xiàn)過程嗎？鑒于這些結(jié)果，這是一個明確的可能性。

另一方面，qEV具有高度可擴(kuò)展性，柱子有多種尺寸可適用于各種樣本類型。此外，我們提供了高度自動化的EV分離純化過程，使用qEV可以實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的分離純化，非常適合用于提供高質(zhì)量的診斷測試。

圖4.自動餾分收集器（AFC）與qEV相結(jié)合，可以實現(xiàn)精確、可定制和可重復(fù)的分離純化。

對于癌癥診斷，應(yīng)選擇哪種分離方法？當(dāng)然，我們是有偏見的，因為我們制造qEV尺寸排阻柱。但更多的科學(xué)證據(jù)支持了我們的觀點，EV診斷研究人員正轉(zhuǎn)向尺寸排除色譜，主要是因為相對于其他方法，它具有高度可擴(kuò)展性和可重復(fù)性。使用qEV允許從臨床樣本中標(biāo)準(zhǔn)化、自動化地分離純EV用于診斷目的。使用更純的EV，通過自動化和優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品帶來的可重復(fù)性，使用qEV分離系統(tǒng)將確保您處于最佳位置，以識別有意義的生物標(biāo)志物，以確�；颊攉@得所需的早期診斷。

事實上，我們的qEV已經(jīng)被腫瘤診斷領(lǐng)域的研究人員在許多研究中使用。例如，Mercy Bioanalytics在其Mercy Halo™診斷測試中使用我們的qEV，如最近的一篇預(yù)印本所述，該預(yù)印本側(cè)重于在人血漿中檢測早期卵巢腫瘤。在非小細(xì)胞肺癌領(lǐng)域，David P. Carbone和Andreas Möller的小組使用qEV來追蹤疾病軌跡和治療反應(yīng)。在乳腺癌方面，Sima Lev的團(tuán)隊使用qEV分離EV來分析疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)，F(xiàn)rancesco Fabbri的團(tuán)隊使用qEV分離EV來識別早期診斷生物標(biāo)志物，Clotilde Théry和Charlotte Proudhon的團(tuán)隊使用qEV柱識別轉(zhuǎn)移性疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。在前列腺癌的研究中，Rienk Nieuwland的團(tuán)隊在阿姆斯特丹大學(xué)醫(yī)療中心的研究中使用了qEV，Karla C. Williams及其團(tuán)隊使用了qEV來鑒定潛在的血漿生物標(biāo)志物STEAP1。這幾個例子只是癌癥研究人員使用qEV的文獻(xiàn)中的一小部分。

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