二代測序（NGS）以其無與倫比的高測序精度和高通量優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于各個生物學(xué)研究領(lǐng)域，包括全基因組測序、全外顯子測序、目標(biāo)區(qū)域測序、mRNA測序、small RNA測序、Lnc RNA測序、circle RNA測序、單細(xì)胞測序、Chip測序、甲基化測序等。

 

在測序文庫的制備中，片段長度是文庫的一個重要指標(biāo)。對于以Illumina為代表的二代測序而言，測序的片段長度一般是幾十至幾百bp。因此，保證測序文庫的片段長度符合測序要求，成為獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵指標(biāo)。如果文庫片段長度過短，會產(chǎn)生大量無用數(shù)據(jù)且浪費(fèi)測序儀的測序潛力；片段過長，又會隨著讀長延長導(dǎo)致測序的錯誤率升高。

不僅如此，對一些特殊類型的樣本進(jìn)行測序，由于其片段長度集中在某一特定長度區(qū)間，因此精準(zhǔn)回收相應(yīng)長度的DNA片段，可相對富集這類DNA確保實(shí)驗(yàn)成功。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)DNA片段回收方式，如手工切膠回收、磁珠回收等方式，在回收精確度、重復(fù)性等多個方面無法達(dá)到要求。

基于上述背景，為幫助研究人員實(shí)現(xiàn)DNA片段精準(zhǔn)回收，美國Sage Science公司提供以Blue Pippin為代表的一系列全自動DNA片段回收產(chǎn)品，其優(yōu)秀的性能表現(xiàn)，得到全球超過3000家客戶的認(rèn)可，國內(nèi)裝機(jī)數(shù)量400臺左右，同時多達(dá)2萬篇應(yīng)用文獻(xiàn)，包括眾多Nature、Science、Cell系列等一線主刊的文章，現(xiàn)已成為DNA片段篩選回收領(lǐng)域的行業(yè)金標(biāo)準(zhǔn)。

Blue Pippin可以精準(zhǔn)回收小到幾十至幾百bp（二代測序應(yīng)用），大到幾十kb的片段（三代測序應(yīng)用）。研究人員只需要在軟件中輸入回收范圍的bp值，儀器自動精準(zhǔn)的回收目標(biāo)DNA片段。

鑒于二代測序文庫種類眾多，我們將分?jǐn)?shù)期介紹Pippin系列產(chǎn)品在不同文庫構(gòu)建中的應(yīng)用，本期我們先介紹其在small RNA和chip seq測序建庫中的應(yīng)用。

Small RNA文庫測序

Small RNA是一類長約20～30個核苷酸的非編碼RNA分子，包含miRNA 、siRNA和piRNA等，是一大類調(diào)控分子，幾乎存在于所有的生物體中。因此如何準(zhǔn)確回收small DNA，減少其他非目標(biāo)DNA就成為實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。small RNA文庫加上adapter接頭后其長度一般在140-150bp左右，前后存在大量雜帶，用Blue Pippin系列產(chǎn)品可以精準(zhǔn)回收相關(guān)片段，將雜帶徹底去除干凈，有效提高測序質(zhì)量和效率。（圖1）

圖1 某研究中small RNA回收效果比較

相關(guān)應(yīng)用文獻(xiàn)：

1	Mayo-Muñoz, David, et al. "Type III CRISPR-Cas provides resistance against nucleus-forming jumbo phages via abortive infection." Molecular cell 82.23 (2022): 4471-4486.
2	Lee, Min Young, et al. "Distinct profiles of cell-free microRNAs in plasma of veterans with post-traumatic stress disorder." Journal of Clinical Medicine 8.7 (2019): 963.
3	Emilie Cardona, E., et al. "Circulating miRNA diversity, origin and response to changing metabolic and reproductive states, new insights from the rainbow trout." bioRxiv (2021): 2021-04.
4	Dinh, Phuong-Uyen C., et al. "Inhalation of lung spheroid cell secretome and exosomes promotes lung repair in pulmonary fibrosis." Nature communications 11.1 (2020): 1064.
5	Toden, Shusuke, et al. "Cancer stem cell–associated miRNAs serve as prognostic biomarkers in colorectal cancer." JCI insight 4.6 (2019).
6	Mills, Mary Katherine, et al. "microRNA Expression Dynamics in Culicoides sonorensis Biting Midges Following Blood-Feeding." Insects 14.7 (2023): 611.
7	Anastasakis, Dimitrios G., et al. "A non-radioactive, improved PAR-CLIP and small RNA cDNA library preparation protocol." Nucleic Acids Research 49.8 (2021): e45-e45.
8	Hamilton, Matthew, et al. "Assessing spermatozoal small ribonucleic acids and their relationship to blastocyst development in idiopathic infertile males." Scientific Reports 12.1 (2022): 20010.

ChiP-seq相關(guān)應(yīng)用

將ChIP與第二代測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進(jìn)行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。

對于ChiP-seq測序，常規(guī)的切斷方法有酶切和超聲打斷，而DNA與組蛋白復(fù)合物往往集中在150-350bp，通過Pippin系列產(chǎn)品對這些對應(yīng)的片段進(jìn)行定向富集和回收，可以顯著提高測序結(jié)果信噪比。

相關(guān)文獻(xiàn)：

1	Wilbanks, Elizabeth G., et al. "A workflow for genome-wide mapping of archaeal transcription factors with ChIP-seq." Nucleic acids research 40.10 (2012): e74-e74.
2	Tao, Fang, et al. "An optimized chromatin immunoprecipitation protocol using Staph-seq for analyzing genome-wide protein-DNA interactions." STAR protocols 3.4 (2022): 101918.
3	Fitz, Nicholas F., et al. "Genome-wide alteration of histone methylation profiles associated with cognitive changes in response to developmental arsenic exposure in mice." Toxicology Reports 9 (2022): 393-403.
4	Li, Yichao, et al. "Differential gene expression identifies a transcriptional regulatory network involving ER-alpha and PITX1 in invasive epithelial ovarian cancer." BMC cancer 21.1 (2021): 1-18.
5	Hogg, Simon J., et al. "Distinct modulation of IFNγ-induced transcription by BET bromodomain and catalytic P300/CBP inhibition in breast cancer." Clinical Epigenetics 14.1 (2022): 1-15.
6	Papale, Ligia A., et al. "Gene by environment interaction mouse model reveals a functional role for 5-hydroxymethylcytosine in neurodevelopmental disorders." Genome Research 32.2 (2022): 266-279.
7	Abraham, Brian J., et al. "Small genomic insertions form enhancers that misregulate oncogenes." Nature communications 8.1 (2017): 14385.

環(huán)亞生物科技有限公司作為美國Sage Science公司DNA片段回收系列產(chǎn)品在中國區(qū)的獨(dú)家代理商，自2011年以來將Sage Science的產(chǎn)品線引入國內(nèi)，一直為國內(nèi)用戶提供專業(yè)的全自動核酸片段回收系統(tǒng)的安裝測試、應(yīng)用培訓(xùn)，技術(shù)支持與售后維護(hù)工作，贏得客戶的一致好評與信任。環(huán)亞生物科技有限公司將一如既往地支持越來越多的Sage Science用戶。

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