在臨床應用中，慢病毒作為細胞與基因治療的常用載體，相關制劑的純度和質量均需符合GMP標準。而慢病毒生產(chǎn)過程中會引入非病毒成分的雜質（如細胞碎片、蛋白聚集體）和病毒成分的雜質（如空殼病毒、游離RNA等）。因此，對生產(chǎn)過程中以及慢病毒終產(chǎn)品進行多維度的定量分析必不可少，亟需一種快速、高通量的慢病毒顆粒滴度、純度、空殼率等指標的檢測方法。

NanoFCM基于自身的技術平臺開發(fā)了一種高靈敏、快速、直接、無創(chuàng)的慢病毒表征解決方案，在前期研發(fā)、生產(chǎn)、純化、質控、穩(wěn)定性評估等各個階段均具有極高的應用價值。該方法操作簡單、檢測速度快、準確性高、適用性廣，適用于不同種類的病毒樣顆粒和病毒載體的分析。主要優(yōu)勢如下，

低損耗
僅需（10 mＬ）上樣量，且單次檢測樣品消耗量不足1 mＬ。

多參數(shù)
單次檢測可實現(xiàn)多種結構組分鑒定，為慢病毒顆粒滴度、純度、空殼率等信息提供快速檢測方案。

高通量
檢測僅需2-3 min即可獲得高通量并具有統(tǒng)計代表性的數(shù)據(jù)結果，擁有完整的試劑解決方案，無需摸索實驗流程。
 

圖.慢病毒高通量表征平臺

本期小編將基于慢病毒的表征平臺展開方案介紹：

粒徑、濃度檢測
納米流式檢測儀以每分鐘高達上萬個顆粒的檢測速率實現(xiàn)單個慢病毒的逐一檢測，獲得具有統(tǒng)計代表性的粒徑分布和濃度信息（如下圖1所示），也可快速獲得不同亞群的信息，對慢病毒樣品進行梯度稀釋，NanoFCM的檢測結果與稀釋度呈現(xiàn)很好的線性結果（R²>0.99）。這種多、快、省的檢測方法，可用于慢病毒生產(chǎn)過程中增殖狀態(tài)的實時監(jiān)控。
 

圖1. 慢病毒粒徑、濃度和稀釋線性測試

膜染料測定純度
我司研發(fā)的膜染料可對慢病毒生產(chǎn)過程中無膜結構的顆粒進行純度分析，經(jīng)脂膜染料標記，結果顯示該慢病毒樣本純度為91.2%（如圖2所示），揭示慢病毒樣本中絕大部分為具有膜結構的顆粒，且熒光強度與顆粒粒徑正相關。
 

圖2. 膜染料標記的慢病毒純度（膜染料訂購信息如下表所示）
 

核酸包裝效率分析
核酸染料可透過慢病毒莢膜及衣殼蛋白，與內(nèi)部核酸分子結合而發(fā)出熒光。如圖3所示，該慢病毒載體樣本中絕大部分的顆粒成功裝載了基因組（89.7%），但仍存在一部分未裝載核酸的慢病毒顆粒。
 

圖3. 核酸染料標記的慢病毒純度（核酸染料訂購信息如下表所示）
 

慢病毒膜內(nèi)蛋白p24測定
經(jīng)膜透化試劑處理和抗體標記，NanoFCM可對慢病毒莢膜內(nèi)部的蛋白進行定量分析，從而實現(xiàn)p24等慢病毒內(nèi)部蛋白的檢測。下圖4顯示的是該慢病毒樣本中，p24陽性率僅為55.1%，結合上述莢膜和核酸染色的數(shù)據(jù)揭示并非所有的慢病毒顆粒均有p24蛋白的表達。
 

圖4. 病毒內(nèi)部蛋白p24檢測（p24檢測相關試劑訂購信息如下表所示）

功能性慢病毒測定
慢病毒樣本中往往是多種組分共存，如完整慢病毒、部分組裝的慢病毒、游離核酸等。VSV-G陽性的慢病毒可侵染細胞——“識別”，核酸陽性慢病毒攜帶靶基因——“貨物”，故功能完整的慢病毒需要同時具有基因組和VSV-G。如下圖5所示，通過對慢病毒樣品進行核酸和VSV-G蛋白熒光標記，NanoFCM僅需要2-3 min就可以區(qū)分完整病毒、空殼、游離核酸等不同結構。
 

圖5 功能性慢病毒顆粒檢測（病毒組分鑒定相關試劑如下表所示）

慢病毒滴度測定比較
慢病毒滴度測定常通過ELISA對p24進行定量分析進而計算出慢病毒物理滴度，或通過侵染活性測試確定轉導滴度。與p24定量方法相比，NanoFCM可直接測定慢病毒的顆粒濃度，通過對莢膜內(nèi)p24蛋白的標記，實現(xiàn)p24陽性的病毒顆粒的定量分析。進一步通過核酸和VSV-G標記，發(fā)展了對功能性慢病毒進行快速定量分析的方法�；�于NanoFCM發(fā)展的慢病毒定量分析方法與轉導滴度的結果對比（如圖6），結果表明該慢病毒的particle-to-PFU ratio為100以上，針對p24蛋白的ELISA病毒滴度測定極易受游離p24蛋白的影響，相比之下NanoFCM所得結果與病毒的物理滴度更為吻合。
 

圖6. 慢病毒滴度測定