利用超長距離分子堆疊工程NIR-II熒光團實現(xiàn)對深部病變的高對比度識別
本文要點：與熒光成像的經(jīng)典光譜范圍（低于900 nm）相比，近紅外二區(qū)（NIR-II，900-1880 nm）窗口具有中等的光吸收、較少的光子散射和最小化的組織自發(fā)熒光，為活體深度信號的高保真檢測提供了潛在的可能。然而，NIR-II熒光團的有限信號和散射光子引起的強背景使在深部組織受到干擾的情況下進行體內(nèi)高對比度熒光成像仍然具有挑戰(zhàn)性。為了實現(xiàn)具有更高對比度的深度生物成像，有必要在明亮的染料和背景抑制的成像窗口之間進行匹配，以實現(xiàn)更高性能的NIR-II熒光成像。
本研究通過增強給電子能力、減少供體-受體（D-A）距離合成了一種NIR-II熒光小分子，具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射特性和高亮度，且最大發(fā)射超過1200nm，是一種稀缺的明亮長波長發(fā)射有機染料。所設(shè)計的納米熒光團具有延伸至1900nm的明亮熒光信號，與背景抑制成像窗口相匹配，使組織圖像的信噪比達到100以上，組織穿透厚度約為4-6 mm。此外，幾乎可以在零背景下識別出強烈負染的管腔內(nèi)病變。該方法可以為未來長波長NIR-II分子設(shè)計和深度、高散射組織的生物醫(yī)學(xué)成像提供新的途徑。
作者從先前報道的優(yōu)良分子2TT-oCB開始，通過分子轉(zhuǎn)子工程設(shè)計了三種染料（圖1a）。從2TT-oCB到2MTT-oCB，引入了甲氧基電子供體基團，增強了給電子能力和D-A相互作用；從2MTT-oCB到2MPT-oCB，去除了三苯胺中的苯基從而顯著縮短D-A距離；最后設(shè)計了具有電子供體芴單元的2FT-oCB來調(diào)節(jié)D-A相互作用。此外，還設(shè)計了BBTD的受體核，當與電子供體耦合時，中心BBTD核心的強吸電子能力可以將吸收/發(fā)射驅(qū)動到長波長范圍。圖1b中顯示了2FT-oCB高度扭曲的分子結(jié)構(gòu)，在分子堆積狀態(tài)下可見2FT-oCB分子傾向于以~8.5Å的超長距離平行分布，有效地減少了分子間的相互作用。
接著作者研究了四種染料在四氫呋喃（THF）溶液中的光物理性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)增加供體能力和修剪π橋可以有效地增強D-A相互作用，不僅可以使最大吸收波長紅移，而且可以提高吸收強度。所設(shè)計的染料可作為NIR-II發(fā)射器用于深層組織可視化（圖1c-d）。
本研究中的染料分子具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射（aggregation-induced emission, AIE）性質(zhì)，即在稀溶液中幾乎沒有發(fā)射，但在濃縮或聚集狀態(tài)下顯示出明亮的發(fā)射。為研究聚集態(tài)下的熒光性質(zhì)，對染料在具有不同水分數(shù)（ƒw）的THF/水混合物中的光致發(fā)光（PL）光譜進行了研究。如圖1e所示，當ƒw從0增加到40%，染料的PL強度下降，這是由于形成了暗扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移態(tài)；而隨著ƒw從40%增加到90%，PL強度顯著增加，這是因為通過聚集形成限制分子內(nèi)運動的機制觸發(fā)了AIE效應(yīng)。值得注意的是，本工作中的分子（特別是2MPT-oCB和2FT-oCB）可以被列為具有最長發(fā)射波長的AIE分子之一。
為了進一步研究染料的熒光性質(zhì)，作者使用生物相容性表面活性劑Pluronic F-127通過納米沉淀法將染料封裝成熒光點（圖2a）。除了2MPT-oCBdots外，其他3種染料點相較于溶液狀態(tài)均顯示出最大吸收波長紅移（圖2b）；這些熒光點分別在NIR-II區(qū)域顯示熒光，比它們的溶液狀態(tài)稍微藍移（圖2c）。2MPT-oCB和2FT-oCB點優(yōu)異的吸收（>840nm）和發(fā)射（>1100nm）特性特別有利于高質(zhì)量的生物成像。使用七種不同的長通（LP）濾光片記錄具有相同濃度的4種染料點的熒光圖像（圖2d）。隨著濾光片波長從1100增加到1500nm，在2FT-oCB點中始終觀察到強烈的熒光信號，且在1400nm LP濾光片下具有最強的熒光強度。因此，選擇2FT-oCB點用作接下來的體內(nèi)成像。
以1,2-二氯乙烷（0.5%）中的IR-26為參考，超過900nm的2FT-oCB點的QY為~0.95%，超過1400nm的QY為~0.11%（圖2e）。F-127涂覆的2FT-oCB測量直徑約為50nm（圖2f）。在連續(xù)激光照射30分鐘后，2FT-oCB點幾乎沒有顯示出熒光強度的下降（圖2g），證明它具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性。
為確定NIR-II熒光非峰成像的最佳高通檢測區(qū)域，考慮到水中2FT-oCB點的發(fā)射光譜和水的光吸收特性（圖3a），通過蒙特卡羅方法模擬了垂直線樣品在作為背景的水平線上1300-1700 nm范圍內(nèi)的成像（圖3b）。計算的變異系數(shù)（Cv）顯示， NIR-IIx+ NIR-IIb（1400-1700 nm）圖像的擴散抑制效果最好。接著在靜脈注射1×2FT-oCB點的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）溶液后，對小鼠進行全身血管成像。結(jié)果顯示，1400LP收集抑制了強背景，使血管網(wǎng)絡(luò)輪廓清晰（圖3c–e），肝臟上方的血管顯示出1.27的最佳信噪比（圖3f）。在快速傅立葉變換（fast Fourier transform, FFT）的結(jié)果中可以看出圖像不同區(qū)域的空間頻率分布（圖3g–i）。高空間頻率的強度與受約束的光子散射近似正相關(guān)，且在光吸收峰值波長附近出現(xiàn)最大值（圖3j）。由于水在~1450 nm處的強烈光吸收，由散射成分產(chǎn)生的背景被高度抑制，導(dǎo)致NIR-IIx+ NIR-IIb圖像有更高的空間頻率，甚至比一直被認為質(zhì)量最好的NIR-IIb圖像更高。
在生物相容性實驗中發(fā)現(xiàn)，2FT-oCB點沒有表現(xiàn)出明顯的毒性跡象。通過分析水和重水的典型吸收光譜發(fā)現(xiàn)，以水作為溶劑會導(dǎo)致NIR-II區(qū)域的熒光損失，而2FT-oCB dots在重水中的分散能夠恢復(fù)1450nm附近的發(fā)射損耗，因此通過超濾后重新洗脫濃縮2FT-oCB dots制得重水分散體。在此基礎(chǔ)上，作者進行了體內(nèi)熒光結(jié)腸、膀胱和子宮成像。
結(jié)腸灌注重水分散的2FT-oCB dots后，在NIR-II區(qū)域的不同成像窗口中進行熒光結(jié)腸造影。（圖4a，補充圖44）。所提出的NIR-IIx+ NIR-IIb檢測的非侵入性成像模式，即使在嚴重組織紊亂的3-6mm深度下，也能提供接近50的SBR（~46.6）（圖4b）。為了從成像背景定量劃分目標區(qū)域，使用三個閾值（TH=0.27、0.32和0.37，表示所選區(qū)域中最高亮度的27%、32%和37%被設(shè)置為信號/背景確定的閾值），通過二值化處理所選原始結(jié)果（圖4c）。總體趨勢是，計算面積隨著成像波長的紅移而縮�。▓D4d）。將計算出的分割結(jié)腸的平均強度作為信號，將其余部分的平均強度視為背景來確定面積SBR，可得SBR值在1400LP收集時達到最大值。
膀胱內(nèi)滴注重水分散的2FT-oCB點后，通過皮膚和肌肉進行NIR-II熒光膀胱造影。將膀胱的非侵入性NIR-II熒光圖像設(shè)置為綠色通道（圖4e）。組織深度為2-3 mm的情況下， NIR-IIx+ NIR-IIb熒光膀胱圖像的SBR達到~46.5（圖4f）。二進制和分割膀胱圖像表明NIR-IIx+ NIR-IIb光譜窗口最小化了散射干擾（圖4g）。膀胱信號面積和面積SBR的計算值還證明了1400-1700 nm的成像性能最佳（圖4h）。此外，將打開腹部后的膀胱圖像設(shè)置為紅色通道進行比較，然后將綠色和紅色圖像合并為一個圖像，并將一致性高的區(qū)域顯示為黃色，并通過結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)測度（structural similarity index measure, SSIM）進行精確量化以幫助圖像質(zhì)量評估（圖4i）。1400-1700 nm的合并膀胱圖像顯示出最佳匹配，并且性能超過NIR-IIb區(qū)域。整個SSIM圖中的平均SSIM指數(shù)如圖4j所示。隨著成像窗口的延長，SSIM指數(shù)逐漸提高，在1400-1700 nm圖譜上達到峰值，與NIR-II非侵入性可視化中的NIR-IIx+ NIRIIb檢測具有最高的一致性。
不同NIR-II光譜區(qū)域中2FT-oCB點結(jié)腸灌注的熒光結(jié)腸造影圖像（比例尺，5mm）。
子宮灌注重水分散的2FT-oCB dots后，將小鼠下腹暴露于793nm連續(xù)波（CW）激光的照射下。NIR-II及NIR-IIx+ NIRIIb熒光子宮圖像分別如補充圖55a、圖5a所示。即使組織厚度為4-6 mm，1400 nm LP圖像也能提供最佳成像質(zhì)量（圖5b），且1400-1700 nm窗口提供了最精確的區(qū)域分割和最高的面積SBR值（圖5c）。在NIR-IIx+ NIR-IIb圖像中，右子宮直徑計算值的FWHM最小，為1.69mm（圖5d）。
之后，作者發(fā)現(xiàn)利用2FT-oCB dots可以實現(xiàn)幾乎為零背景的精確宮內(nèi)殘留物檢測。在吸收峰周圍的光譜區(qū)域內(nèi)，水的光吸收將耗盡散射光子，而殘留組織往往富含水，這導(dǎo)致光吸收而在明亮信號周圍產(chǎn)生強烈的陰性染色，可以為進一步診斷提供鮮明的對比。將超吸收性樹脂填充到子宮腔中，充當微小異物（圖5e）。在腹部縫合和宮內(nèi)注射重水分散的2FT-oCB dots后進行體內(nèi)成像（圖5f）。結(jié)果如圖5g所示，隨著子宮蠕動和輔助按壓，組織深度以及組織中斷減少，宮內(nèi)異物越來越清晰可見。
為了更好地模擬內(nèi)源性殘留物，使用了一批懷孕小鼠（圖5h）。在宮內(nèi)注射重水分散的2FT-oCB dots后，可以清楚地顯示子宮中具有強陰性染色的胎兒（圖5i–k）。將1300LP、1400LP和1500LP圖像放入三個通道，分別進行紅色、綠色和藍色的偽彩色增強。三個通道的合并圖像通常顯示由三原色整合的白色（圖5l）。然而，離重疊結(jié)構(gòu)的中心越遠，合并的顏色從白色逐漸加深到紫色，說明1300LP和1500LP通道中有相對較高的光擴散。如圖5m 所示，NIR-IIx+ NIR-IIb檢測可以準確勾勒胎盤輪廓。
然后，進一步進行漏流產(chǎn)的檢測。在注射脂多糖后第6天，小鼠在宮內(nèi)灌注重水分散的2FT-oCB dots后成像。從圖5n所示的體內(nèi)NIR-IIx+ NIR-IIb圖像中，可以在右側(cè)子宮中觀察到胎兒，并且可以在左側(cè)子宮中精確檢測到一些殘留的妊娠組織。由于殘留的妊娠組織含有大量的水，組織背景在NIR-IIx+ NIR-IIb窗口中被有效抑制，導(dǎo)致強烈的陰性染色。根據(jù)圖5n中的分析， SBR計算值超過100。在輕微的輔助按壓和適當?shù)奈恢谜{(diào)整后，組織阻塞改善，右子宮中的胎兒變得更加清晰（圖5o）。比較打開腹部之前（圖5n，o）和之后（圖5p）的圖像，可知皮膚和脂肪組織的阻礙不會干擾NIR-IIx+ NIR-IIb檢測的精確診斷。最后，進一步切開子宮進行切片和H&E染色（見圖5q）。右側(cè)子宮的切片圖像顯示了小鼠胎兒的完整結(jié)構(gòu)（圖5r），而左側(cè)則包含一團殘留的妊娠組織（圖5s），與體內(nèi)NIR-IIx+ NIRIIb觀察結(jié)果一致。這表明明亮的NIR-IIx+ NIR-IIb發(fā)射和周圍強陰性染色的熒光團的有效標記光吸收峰組成雙可視化，為準確診斷宮內(nèi)殘留提供了強有力的工具。
子宮灌注2FT-oCB點的熒光子宮造影圖像。比例尺，5mm。插圖中提高了亮度。比例尺，3mm。
總之，所合成的2FT-oCB dots可以被列為少數(shù)同時實現(xiàn)長波長光學(xué)響應(yīng)、強光吸收和超過1400/1500nm的高QY的熒光團之一，可作為長波長生物醫(yī)學(xué)熒光成像的潛在候選者，本研究的發(fā)現(xiàn)將為進一步的熒光團制備和生物醫(yī)學(xué)研究帶來變革。
參考文獻
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