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                                當前位置 > 首頁 > 技術(shù)文章 > MeRIP-seq揭示mRNA m6A甲基化調(diào)控擬南芥的抗寒性分子機制中的應(yīng)用

                                MeRIP-seq揭示mRNA m6A甲基化調(diào)控擬南芥的抗寒性分子機制中的應(yīng)用

                                瀏覽次數(shù):575 發(fā)布日期:2023-9-5  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負
                                植物通過改變數(shù)千個基因的mRNA豐度以促進其生理和代謝過程,從而對低溫應(yīng)激進行響應(yīng)。在轉(zhuǎn)錄后水平上,這些冷應(yīng)激應(yīng)答轉(zhuǎn)錄本經(jīng)歷可變剪接、microRNA介導的調(diào)控和可變多腺苷酸化等。最近研究表明,m6A、m5C等RNA修飾可以影響RNA調(diào)控和鑒定mRNA修飾穩(wěn)定性,從而揭示了另一層在調(diào)控基因表達中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。m6A在植物生長發(fā)育中的重要性已經(jīng)得到了重視,但m6A在脅迫條件下的重要性仍未得到充分探討,因此m6A修飾在冷脅迫條件下的應(yīng)激機制研究具有非常重要意義。
                                 
                                2022年8月,美國俄克拉荷馬州立大學Ramanjulu Sunkar團隊和賓夕法尼亞大學Brian D. Gregory團隊合作以“mRNA N6-methyladenosine is critical for cold tolerance in Arabidopsis”為題在《the plant journal 》雜志發(fā)表研究論文,該研究以擬南芥為對象,通過甲基化RNA免疫沉淀測序(MeRIP-seq)揭示了表觀轉(zhuǎn)錄組(m6A甲基化)在擬南芥抗寒性中的關(guān)鍵作用。

                                 
                                標題:mRNA N6-methyladenosine is critical for cold tolerance in Arabidopsis(mRNA N6-甲基腺苷對擬南芥的抗寒性至關(guān)重要)
                                時間:2022-08
                                期刊:the plant journal
                                影響因子:IF 7.2
                                技術(shù)平臺:m6A-seq(MeRIP-seq)、polysomal-seq(翻譯組)、qRT-PCR、Dot-blot等
                                 
                                研究摘要:
                                本研究為了檢測m6A修飾在冷脅迫應(yīng)激響應(yīng)中的作用,對冷脅迫(chilling stress)(4°C)24小時的擬南芥幼苗中進行了甲基化RNA免疫沉淀測序(MeRIP-seq),在轉(zhuǎn)錄組范圍進行m6A甲基化分析,分析揭示了m6A修飾在低溫脅迫下的大范圍變化。由于已知m6A會影響轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性/降解和翻譯,本研究分析了這些可能性,分析結(jié)果表明在冷脅迫下,冷富集m6A轉(zhuǎn)錄本在冷脅迫下表現(xiàn)出mRNA豐度的最大增加,同時核糖體(ribosome)率增加。利用m6A甲基轉(zhuǎn)移酶主要基因突變的mta突變體進一步評估m(xù)6A表觀轉(zhuǎn)錄組對植物抗寒性的意義。與野生型相比,隨著CBF和COR基因表達水平的差異,mta突變體對冷處理表現(xiàn)出超敏反應(yīng),這由根的初生生長、生物量和活性氧積累決定。此外,非馴化和冷馴化的mta突變體都表現(xiàn)出對抗冷凍的超敏反應(yīng)。總之,本研究表明了表觀轉(zhuǎn)錄組在擬南芥抗寒性中的關(guān)鍵作用。

                                 

                                研究結(jié)果
                                (1)MeRIP-seq鑒定在冷脅迫下m6A富集或m6A缺失的轉(zhuǎn)錄本

                                圖1:擬南芥m6A表現(xiàn)出3′UTR位點偏倚,對冷脅迫無響應(yīng)的peaks偏倚更強。

                                 
                                (a) 冷處理樣品和對照處理樣品的生物學重復(fù)進行重疊獲得的高置信度m6A peaks分析鑒定出5829個對照富集(冷缺失)peaks、1318個冷富集m6A peaks和11個 943個共有peaks(未改變)。
                                (b) MeRIP-seq reads沿分類轉(zhuǎn)錄本的分布。
                                (c) 通過homer鑒定的RNA motif在目標m6A peaks區(qū)域中富集。
                                (d) 與5′UTR、起始密碼子、CDS、終止密碼子和3′UTR重疊的冷富集、對照富集和共有m6A peaks的百分比分布。
                                (e) 轉(zhuǎn)錄本的冷富集、對照富集和共有m6A peaks起始和終止密碼子周圍區(qū)域甲基化的核苷酸水平。每個組都被標準化為其在該區(qū)域中的最大值

                                (2)冷應(yīng)激誘導大范圍轉(zhuǎn)錄組變化
                                圖2:低溫脅迫24小時后的轉(zhuǎn)錄組學分析結(jié)果表明,已知的主要冷響應(yīng)基因的mRNA豐度增加。
                                (a)與對照Col-0植株相比,低溫處理植株的整體冷誘導的轉(zhuǎn)錄組變化MA圖。紅點代表RNA豐度變化有統(tǒng)計學意義的轉(zhuǎn)錄本(調(diào)整P<0.05),灰色表示沒有變化的轉(zhuǎn)錄本。藍點突出顯示已知與植物冷脅迫響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。
                                (b)在冷脅迫期間顯著增加或減少的轉(zhuǎn)錄本相關(guān)的GO分析熱圖
                                (c) 冷處理和對照條件下mRNA豐度的倍數(shù)變化與轉(zhuǎn)錄本的冷處理和對照組中富集m6A peaks的差異及共有分析
                                 
                                (3)冷富集m6A peaks的轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出多聚體結(jié)合增加
                                圖3:冷富集m6A轉(zhuǎn)錄本的peaks對冷處理表現(xiàn)出更高的mRNA豐度和核糖體占有率
                                (a) 對照處理和冷處理之間轉(zhuǎn)錄本的核糖體占有差異,比較只冷處理和只對照中轉(zhuǎn)錄組富集m6A peaks之間的差異,以及在兩種條件下的共有差異。
                                (b)對冷富集m6A轉(zhuǎn)錄本的peaks GO分析的生物功能分類。
                                (c) 基因組瀏覽器視圖(Genome browser views)分析比較主要已知冷調(diào)控轉(zhuǎn)錄本的meRIP-seq(標記為m6A)、mRNA-seq(標為mRNA)和多聚體分析(polysome profiling,標記為Ps-seq)。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄的方向。

                                (4)mta突變體植株對冷脅迫表現(xiàn)出超敏反應(yīng)

                                圖4:與Col-0植株相比,mta突變體的冷響應(yīng)揭示了mRNA豐度和多聚體負載差異。
                                (a)qPCR方法檢測與Col-0植物相比,對照和冷條件下MTA突變體中MTA轉(zhuǎn)錄本的相對mRNA水平。
                                (b)與Col-0植株相比,mta突變體的表型檢測和冷響應(yīng)定量分析,
                                (c)根長(對照幼苗在22°c下生長10 天,而在冷處理下幼苗生長了52天)
                                (d)鮮重。
                                (e) 長期低溫脅迫后葉片組織中ROS的積累情況。

                                 
                                圖5:通過電解質(zhì)滲漏測定法(electrolyte leakage assay)分析mta突變體對冷凍脅迫響應(yīng)的敏感性。
                                對5周齡的未馴化(NA)(a)和冷馴化(CA,4°C,7 天)(b)的Col-0和mta突變體植株進行電解質(zhì)滲漏檢測分析。✳表示有統(tǒng)計學意義的差異(P<0.05,t檢驗)。

                                (5)冷脅迫下mta突變體的CBF和COR基因表達水平
                                圖6:qPCR分析表明,冷富集m6A轉(zhuǎn)錄本與RNA豐度以及核糖體占有率之間存在潛在相關(guān)性。在Col-0和mta中,候選CBF和COR基因的相對mRNA豐度和多聚體負載的變化通過對照和低溫條件下的倍數(shù)變化來分析。

                                參考文獻:
                                Govindan G, Sharma B, Li YF, Armstrong CD, Merum P, Rohila JS, Gregory BD, Sunkar R. mRNA N6 -methyladenosine is critical for cold tolerance in Arabidopsis. Plant J. 2022 Aug;111(4):1052-1068.
                                來源:深圳市易基因科技有限公司
                                聯(lián)系電話:0755-28317900
                                E-mail:wuhuanhuan@e-gene.cn

                                標簽: RNA甲基化
                                用戶名: 密碼: 匿名 快速注冊 忘記密碼
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