細胞外囊泡(EVs)作為疾病生物標志物和藥物遞送載體，具備巨大的臨床潛力，已然成為當今生命科學和醫(yī)學研究領(lǐng)域的“當紅辣子雞”。細胞種類、細胞狀態(tài)以及分泌途徑的多樣性，從細胞上清或體液中分離得到的EVs在物理性質(zhì)和分子組成上具有高度的個體差異性和多樣性，此外，由于絕大多數(shù)EVs粒徑小于200 nm且缺乏通用的標志蛋白，因此如何在單顆粒水平對其進行分析而揭示其異質(zhì)性一直是亟待突破的瓶頸問題。磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)作為EVs的固有特性，基于親脂性膜染料(lipophilic membrane dyes, LMDs)的EVs熒光標記已成為一種普適性策略，廣泛應用于熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)等單顆粒EVs分析表征中。此外，親脂性膜探針(lipophilic membrane probes, LMPs)因其對EVs脂膜的嵌入也被廣泛用于EVs的捕獲和富集。然而，不管是基于染料還是探針對于EVs脂膜的標記性能均尚未有系統(tǒng)的考察報道，譬如：
01 LMDs是否能夠標記上所有的EVs？
02 LMDs在緩沖液中自團聚形成的熒光膠束顆粒對EVs準確檢測的干擾情況？
03 LMDs是否也同樣會標記EV樣本中的常見污染物——脂蛋白，以及該標記對EV樣本分析的影響？

2023年7月31日，廈門大學顏曉梅教授課題組在Journal of Extracellular Vesicles在線發(fā)表題為"Quantitative assessment of lipophilic membrane dye-based labelling of extracellular vesicles by nano-flow cytometry"的研究論文(JEV, 2023, e12351), 報道了該團隊利用納米流式檢測裝置(nano-flow cytometer, nFCM)對多種LMDs和LMPs標記EVs的效果進行定量評估，對EVs膜染料標記中常見的問題給出了答案。

如圖1所示，EV樣品與LMD稀釋液進行共孵育，標記完成后超離去除游離的LMDs，隨后在納米流式上進行分析。如果一個顆粒只有散射光信號沒有熒光信號，它就被認為是未標記的EV (Unlabeled EV)。再結(jié)合EV樣本的純度信息，即可通過熒光顆粒占總顆粒的比例，反映出LMD對EVs的標記效率。

圖1. 脂膜染料標記EVs及檢測流程示意圖
 

該研究選取了PKH67、PKH26、Di-8-ANEPPSF和Dil四種最常見的膜染料，分別對人工合成的脂質(zhì)體、細胞上清和血漿等不同來源的EVs進行標記。首先驗證了四種膜染料對脂質(zhì)體的標記效率均接近90%，這與表面活性劑Triton X-100處理分析純度（處理方法參見往期文章：外泌體純不純，一聞就知）的結(jié)果(93.2%)高度吻合，這也就說明四種LMDs對脂質(zhì)體的標記不具有選擇性。

細胞上清來源EVs的LMD標記
首先采用表面活性劑處理的方法對超速離心所得HCT-15細胞來源的EV樣本純度標定為88.3%，之后經(jīng)不同濃度的LMDs（1、2、4和8 mM）的染色標記。結(jié)果表明PKH67和PKH26染料僅能標記約60%-80%的細胞培養(yǎng)上清來源EVs，而di-8-ANEPPS和高濃度的DiI可以實現(xiàn)樣本中EVs的高效且均勻的熒光標記，其中di-8-ANEPPS的標記效率接近100%，而DiI的標記效率為70%-100% （圖2）。
 

圖2. HCT-15細胞來源EVs的LMDs膜標記效率分析

膜染料自身團聚
由于LMDs自身化學結(jié)構(gòu)的特性，易發(fā)生自團聚而形成膠束顆粒。在此對所選擇的四種LMDs（PKH67、PKH26、Di-8-ANEPPSF、Dil）的自團聚情況進行了考察，以探索形成膠束對于EVs分析的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著LMDs濃度從 1 mM升高至8 mM的過程中，自團聚顆粒數(shù)增加但其顆粒粒徑和熒光強度基本不變；且PKH67和PKH26相較于di-8-ANEPPS和DiI更容易形成自團聚膠束，但是各自染料的最佳染色濃度下，自團聚產(chǎn)生的膠束顆粒數(shù)量較低，對整體結(jié)果影響較低。
 

圖3. PKH67、PKH26、di-8-ANEPPS和DiI的自團聚情況評估

LMDs對血漿來源EVs的標記
血漿中大量脂蛋白和乳糜顆粒的存在，易導致來源于血漿的EV（PFP-EVs）樣本中通常會存在脂蛋白和其他蛋白團聚體的污染。作者在此選擇與EVs粒徑和密度均高度重疊的極低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein, VLDL）作為研究模型來評估LMD對常見污染物的標記（圖4）。四種LMDs對幾乎所有的VLDL顆粒均可進行標記，這也說明了脂蛋白等雜質(zhì)的存在會對依賴LMD標記的EV分析產(chǎn)生干擾。不同健康志愿者PFP-EV樣本的純度存在一定差異，平均為73%。結(jié)果顯示PKH67和PKH26染料僅能夠標記約40-70%的PFP-EVs，且過量的PKH26會對EVs的結(jié)構(gòu)造成損害。Di-8-ANEPPS的標記比例為80%，高于EV樣本的純度，推測是EV樣本中的其它類型脂蛋白也可能被該染料所標記。

圖4. LMDs對VLDL和血漿來源EVs的標記

脂膜探針標記和拷貝數(shù)分析
除了用于EVs的標記之外，LMPs也常被用于EVs的捕獲和富集。在此以DSPE-PEG2000-biotin為研究模型，其中DSPE采用長疏水的碳鏈結(jié)構(gòu)嵌入到EVs的磷脂雙層膜中，PEG則可以提高試劑的水溶性，而biotin標簽則可以用于后續(xù)的親和素的捕獲或者標記。如圖5所示，對于DSPE-PEG2000-biotin孵育后的EVs采用streptavidin-Alexa Fluor 532(AF532)進行標記。1~8 mM濃度的DSPE-PEG2000-biotin對于HCT-15和CCD-18Co兩種細胞來源的EVs的標記效率是穩(wěn)定的且與EVs的純度相當。此外，基于nFCM高靈敏的熒光檢測能力，研究人員首次實現(xiàn)了單個EVs膜表面LMPs嵌入個數(shù)的絕對定量。單個EVs上LMPs的拷貝數(shù)分布從單拷貝到3107不等，中位值為37；同時發(fā)現(xiàn)證實LMPs對EVs的脂膜標記不會干擾抗體對于免疫表型的分析。
 

圖5. 不同來源EVs的LMP標記特性

綜上，作者在該論文中通過nFCM在單顆粒水平對納米生物顆粒進行高通量、多參數(shù)定量分析的性能系統(tǒng)地評估了LMDs/LMPs對于不同來源EVs以及脂蛋白的標記性能，讓研究者們再次以獨道的視角重新審視LMDs/LMPs在EV研究中的應用和限制。

Note：
這個文章的價值其實是建立了膜染料的評價方法。該文章選取的樣品類型是哺乳動物（人）細胞產(chǎn)生的EVs，選取的染料數(shù)量還比較少，市面上有更多類型的商品化膜染料值得探索。由于膜結(jié)構(gòu)的差異，對于植物來源、微生物來源的EVs，膜染料的適用性需要另行評估。