本文要點(diǎn)：幾十年來(lái)，過(guò)量服用對(duì)乙酰氨基酚（APAP）一直是急性肝功能衰竭（acute liver failure, ALF）的主要原因。目前，APAP誘導(dǎo)的肝毒性的發(fā)病機(jī)制仍有待完全闡明。短波紅外光譜區(qū)（shortwave infrared spectral region, SWIR）功能性體內(nèi)成像在疾病診斷、熒光引導(dǎo)手術(shù)和體內(nèi)藥理學(xué)方面具有廣泛的潛力。因此，用于體內(nèi)血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激的SWIR熒光探針可以為APAP毒性的發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)獨(dú)特的視角。
 

近年來(lái)，已經(jīng)有一些關(guān)于具有SWIR區(qū)域吸收的染料的報(bào)道。然而，由于缺乏有效的熒光猝滅機(jī)制，基于這些SWIR染料的探針設(shè)計(jì)仍然很困難。本研究發(fā)現(xiàn)，利用對(duì)稱(chēng)性破缺電荷轉(zhuǎn)移是一種開(kāi)發(fā)具有SWIR熒光團(tuán)的探針的可行方法。同源熒光共振能量轉(zhuǎn)移（homo fluorescence resonance energy transfer, homo-FRET）是一種兩個(gè)具有吸收/發(fā)射光譜串?dāng)_的相同熒光團(tuán)分子間的長(zhǎng)距離偶極-偶極熒光猝滅機(jī)制。由于缺乏熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力，且對(duì)兩個(gè)熒光團(tuán)之間的距離和取向要求嚴(yán)格，它并不是一種特別強(qiáng)的猝滅機(jī)制。當(dāng)兩個(gè)分子接近形成剛性二聚體時(shí)，一種稱(chēng)為對(duì)稱(chēng)性破缺電荷轉(zhuǎn)移（symmetry-breaking charge-transfer, SBCT）的短距離超快分子內(nèi)電子耦合便可起作用，將發(fā)射振動(dòng)弛豫激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)移到一種新的、能量較低的電荷轉(zhuǎn)移態(tài)（通常是暗態(tài)）。

 

 

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七甲基菁（Cy7）是一種經(jīng)典的長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光染料，它的最大吸收波長(zhǎng)可以用不同的頭部集團(tuán)來(lái)調(diào)節(jié)，例如具有苯并吲哚頭基團(tuán)的IR1080，最大吸收波長(zhǎng)約為1000nm。本研究基于IR1080合成了第一個(gè)V型不對(duì)稱(chēng)菁二聚體（VAD1080）（圖1），它的兩個(gè)菁單體被鎖定在非常接近的位置，實(shí)現(xiàn)軌道重疊，從而有效地?zé)晒忖�滅�?/span>

圖1. VAD1080和IR1080的合成

 

作者首先研究了所合成的IR1080與VAD1080在CH2Cl2中的光譜特征。IR1080的吸收和發(fā)射波段具有良好的鏡像關(guān)系（圖2A-B），熒光量子產(chǎn)率為1.2%（以IR1061作為參考）。如圖2E-H, VAD1080的吸收光譜明顯偏離IR1080的吸收光譜，其三峰光譜特征與VAD1080的獨(dú)特傾斜結(jié)構(gòu)特征一致。VAD1080仍然可發(fā)射熒光，盡管其熒光量子產(chǎn)率（Φ=0.08%）與IR1080相比大大降低。

 

進(jìn)一步用CH2Cl2中的瞬態(tài)吸收光譜研究了VAD1080的激發(fā)態(tài)動(dòng)力學(xué)，并與IR1080的激發(fā)態(tài)進(jìn)行了比較，以闡明熒光猝滅的光物理起源。在激發(fā)時(shí)，觀察到IR1080的基態(tài)漂白（ground state bleaching , GSB）和受激發(fā)射（stimulated emission, SE）。在接下來(lái)的100ps左右，GSB信號(hào)以自發(fā)發(fā)射的方式恢復(fù)。根據(jù)GSB和SE的信號(hào)通過(guò)非線(xiàn)性擬合計(jì)算出兩個(gè)壽命，即溶劑化/振動(dòng)弛豫可能為1.4ps，熒光為33ps；而對(duì)于VAD1080，其GSB信號(hào)經(jīng)歷了從1047nm到1000nm的光譜偏移，表現(xiàn)出存在壽命為0.6ps的快速激發(fā)態(tài)路徑，可能進(jìn)入壽命為6.5ps的暗對(duì)稱(chēng)性破缺電荷轉(zhuǎn)移態(tài)。由此驗(yàn)證了SCBT是SWIR菁染料可行的熒光猝滅機(jī)制。

圖2. IR1080和VAD1080在CH2Cl2中的光譜特征。（A–D）IR1080的UV-Vis吸收、熒光發(fā)射光譜以及去卷積吸收和發(fā)射光譜。（E–H）VAD1080的UV-Vis吸收、熒光發(fā)射光譜以及去卷積吸收和發(fā)射光譜。（I）IR1080的兩個(gè)不同波長(zhǎng)的瞬態(tài)吸收光譜和（J）激發(fā)態(tài)動(dòng)力學(xué)。（K）VAD1080的兩個(gè)不同波長(zhǎng)的瞬態(tài)吸收光譜和（L）激發(fā)態(tài)動(dòng)力學(xué)。

 

已知IR1080的多甲基甲酰胺易于被親核活性氧物種破壞，例如與病理性氧化應(yīng)激有關(guān)的ONOO-、ClO-和H2O2。作者設(shè)想，VAD1080菁支架的破壞將去除SCBT途徑，從而恢復(fù)剩余菁骨架的SWIR發(fā)射（圖3A）。因此，VAD1080可能是一種可用于氧化應(yīng)激的開(kāi)啟熒光探針。

為了評(píng)估策略的可行性，作者首先研究了VAD1080在DMF水溶液（v/v=1:1）中對(duì)ONOO-的反應(yīng)性。探針溶液的吸光度為0.6，隨著ONOO-當(dāng)量的增加而連續(xù)下降。這與所提出的ONOO-氧化裂解VAD1080結(jié)合主鏈的機(jī)制不一致（圖3B）�；�于熒光的滴定的趨勢(shì)則有所不同。當(dāng)ONOO-的濃度從0μM逐漸增加到11μM時(shí)，溶液在1004nm處的熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值，增強(qiáng)了61倍。據(jù)推測(cè)，這是由于VAD1080的兩個(gè)菁主鏈中的一個(gè)被切割，消除了通過(guò)SCBT的熒光猝滅，導(dǎo)致熒光顯著增加；而進(jìn)一步添加ONOO-（11–21μM）則導(dǎo)致熒光強(qiáng)度逐漸降低，這可能是由于剩余的菁染料被過(guò)量的氧化物種破壞，熒光隨之消失（圖3C）。這顯然不符合預(yù)期，但如此高濃度的氧化物種從生物學(xué)角度來(lái)看是無(wú)需考慮的。

接著還研究了VAD1080和ONOO-之間的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，反應(yīng)在約100s內(nèi)完成（圖3D）。進(jìn)一步測(cè)試發(fā)現(xiàn)VAD1080也對(duì)其他高氧化物種（如ClO-和·OH）表現(xiàn)出高熒光開(kāi)啟反應(yīng)，而生理水平的生物硫醇與溫和的反應(yīng)性物質(zhì)（如H2O2）不會(huì)導(dǎo)致熒光開(kāi)啟（圖3E）。這些結(jié)果證實(shí)VAD1080可用于高氧化性物種的生物傳感。

圖3.（A）VAD1080對(duì)氧化物種的檢測(cè)機(jī)制。（B）在H2O:DMF（v/v =1:1，含1%TFA）的混合物中，VAD1080（20μM）對(duì)ONOO-的吸收滴定和（C）熒光滴定。λex=940 nm。（D）VAD1080（20μM）與ONOO-的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。（E） VAD1080（20μM）對(duì)各種生物硫化物（每個(gè)物種5當(dāng)量）和不同氧化物種的熒光響應(yīng)。（H2O2：5當(dāng)量；·OH：1當(dāng)量；ClO-：0.5當(dāng)量；ONOO-：0.5當(dāng)量。）

 

最后，作者在小鼠模型中展示了對(duì)APAP誘導(dǎo)的氧爆作用的實(shí)時(shí)體內(nèi)熒光成像的概念驗(yàn)證應(yīng)用。用DSPE-PEG2000磷脂膠束包封VAD1080，以提高其在PBS中的溶解度。對(duì)照組小鼠靜脈注射PBS和VAD1080膠束；接下來(lái)的三組依次注射不同劑量的APAP以及VAD1080；最后一組小鼠注射APAP（300 mg/kg）、N-乙酰半胱氨酸（NAC，300 mg/kg）和VAD1080。在第一個(gè)60分鐘內(nèi)，在對(duì)照組的脈管系統(tǒng)中觀察到微弱信號(hào)（圖4a，第1行）。肝臟中的信號(hào)在60分鐘內(nèi)變得明顯，并在隨后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)逐漸增強(qiáng)。注射150 mg/kg低劑量APAP的小鼠具有良好的耐受性，血管系統(tǒng)或肝臟中沒(méi)有熒光發(fā)射的明顯增強(qiáng)（圖4a，第2行）。用高劑量APAP處理的小鼠的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生了明顯更強(qiáng)的劑量依賴(lài)性熒光信號(hào)，表明發(fā)生了氧化應(yīng)激（圖4a，第3/4行）。這種氧化應(yīng)激可以通過(guò)注射N(xiāo)-乙酰半胱氨酸（NAC）來(lái)抑制（圖4a，第5行）。肝臟熒光開(kāi)啟的動(dòng)力學(xué)與APAP誘導(dǎo)肝損傷的相關(guān)文獻(xiàn)中所報(bào)道的一致。因此，本研究中肝臟熒光強(qiáng)度是肝臟氧化損傷的良好指標(biāo)。

作者分析，肝臟中的熒光開(kāi)啟可能是肝臟中探針直接氧化和肝臟中遠(yuǎn)端生成的氧化產(chǎn)物積累的綜合結(jié)果，而兩者都與血管系統(tǒng)的氧化應(yīng)激有關(guān)。有趣的是，在第一個(gè)小時(shí)內(nèi)熒光開(kāi)啟主要在脈管系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，而肝臟中的信號(hào)直到60分鐘后才開(kāi)始積累（圖4A, C）。這似乎表明APAP首先誘導(dǎo)了血管系統(tǒng)中的氧化。根據(jù)先前的文獻(xiàn)，在APAP給藥的早期階段（約1小時(shí)），ONOO-確實(shí)會(huì)在正弦內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生，導(dǎo)致酪氨酸的硝化，從而對(duì)血管造成損傷。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一觀點(diǎn)（圖4B）。血管系統(tǒng)的持續(xù)氧化應(yīng)激最終導(dǎo)致肝臟中的氧化應(yīng)激和組織損傷，正如肝臟中硝基酪氨酸（NT）蛋白加合物的免疫組織化學(xué)染色所反映的（圖4D），而NAC可以抑制NT蛋白加合物的存在。

 

總之，本研究開(kāi)發(fā)了一種用于SWIR區(qū)域吸收的菁染料“off-on”型熒光探針的設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了一種獨(dú)特的V形不對(duì)稱(chēng)菁二聚體。由于其苯并吲哚頭基的平坦性質(zhì)，兩個(gè)菁單體的近端堆疊在一起，以促進(jìn)SBCT。這種SBCT是一個(gè)ps級(jí)的快速過(guò)程，可以有效地與輻射衰變競(jìng)爭(zhēng)，并有效地猝滅SWIR染料的熒光。在與ONOO-反應(yīng)時(shí)，VAD1080兩種構(gòu)成菁染料的頭基可以被裂解，以抑制SBCT過(guò)程并恢復(fù)剩余菁熒光團(tuán)的SWIR熒光。用APAP處理的小鼠展示了VAD1080在體內(nèi)傳感氧化應(yīng)激的可行性。并且發(fā)現(xiàn)血管系統(tǒng)中的氧化爆發(fā)先于肝臟中的氧化爆發(fā)。本研究為APAP的毒理學(xué)提供了新的見(jiàn)解，為APAP過(guò)量的干預(yù)提供了措施。

 

參考文獻(xiàn)

Wang, M.; Wang, X.; Wei, R.; Zhang, Y.; Chen, J.; Luo, X.; Qian, X.; Yang, Y., Symmetry-breaking charge-transfer enables turn-on fluorescence sensing in the shortwave infrared spectral region for in vivo vasculature redox homeostasis. Sensors and Actuators B: Chemical 2023, 394.

 

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