NovaSeq™ X系列使用XLEAP-SBS化學技術，該技術是我們成熟的因美納邊合成邊測序(SBS)化學技術的升級版，速度更快、保真度更高、性能更可靠。這一革新性的技術使得新一代測序儀的通量和生產(chǎn)力獲得提升，從而改變了大規(guī)模測序的經(jīng)濟效益。本文中，我們展示了NovaSeq™ X系列在五大核心應用方面的提供的數(shù)據(jù)質(zhì)量達到或超過了NovaSeq™ 6000基因測序儀，這些核心應用包括全基因組測序、全外顯子組測序、全轉(zhuǎn)錄組測序、甲基化 測序和單細胞多組學測序。
 

01

使用TruSeq PCR-Free Prep kit (因美納：貨號20015963)從NA12878 基因組 gDNA(Coriell醫(yī)學研究所)樣本中制備全基因組文庫。使用 DRAGEN Germline pipeline v4.1 分析流程進行二級數(shù)據(jù)分析。將測序數(shù)據(jù)降采樣至 30×覆蓋度以比較NovaSeq X Plus和 NovaSeq 6000 基因測序儀之間的變異檢出性能。

評估了全基因組測序(WGS)分析指標，包括單核苷酸變異(SNV)和片段插入缺失(INDEL)的準確率和查全率。NovaSeq X Plus和NovaSeq 6000基因測序儀均可提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)和高度準確的變異檢出(表1、表2)。這些數(shù)據(jù)表明，NovaSeq X 系列的WGS結果達到或超過了 NovaSeq 6000基因測序儀的性能。
 

02

使用 Illumina DNA Prep with Enrichment, (S) Tagmentation (因美納：貨號2002554)從 NA12878基因組gDNA (Coriell醫(yī)學研究所)樣本中制備外顯子組文庫，再由Twist Comprehensive Exome Panel(Twist Bioscience：貨號102033)捕獲其中的目標基因組區(qū)域。使用 DRAGEN Enrichment pipeline v4.0.3 分析流程進行二級數(shù)據(jù)分析。根據(jù)Genome in A Bottle(GIAB) v3.3.2 真值集和hg19-alt-aware參考基因組評估變異檢出的準確度。將測序數(shù)據(jù)降采樣至每個樣本30M reads以比較NovaSeq X Plus和NovaSeq 6000基因測序儀之間的變異檢出性能。
 

對全外顯子組測序(WES)的初級和二級分析指標進行了評估，包括質(zhì)量分值、錯誤率、常染色體基因檢出率、匹配reads百分比、覆蓋均一性以及 SNV和插入缺失的準確率和查全率。NovaSeq X Plus和NovaSeq 6000基因測序儀均可提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)和高度準確的變異檢出(表3、表4)。這些數(shù)據(jù)表明NovaSeq X系列的WES結果與NovaSeq 6000基因測序儀的性能相當。

03

使用 Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo-Zero Plus (因美納：貨號20040529)和 Illumina Stranded mRNA Prep(因美納：貨號20040534)從白血病細胞系RNA: HL-60(Thermo Fisher Scientific：貨號AM7836)和K562(BioChain：貨號R1255820-50)以及乳腺癌細胞系RNA: MCF7(BioChain：貨號 R1255830-50)中制備總 RNA 和信使 RNA(mRNA)文庫。使用 DRAGEN RNA pipeline v4.1 分析流程進行二級數(shù)據(jù)分析。所有樣本的測序數(shù)據(jù)均降采樣至 10M reads以比較基因表達數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)與基因組參照序列聯(lián)盟的人類標準參考基因組 GRCh38(hg38 組裝)進行比對。
 

圖1：全轉(zhuǎn)錄組總RNA-Seq 相關性一一癌細胞系: HL-60、K562和 MCF7 的每百萬轉(zhuǎn)錄本(TPM)。
 

圖 2：全轉(zhuǎn)錄組 mRNA-Seq 相關性一一癌細胞系：HL-60、K562 和 MCF7 的每百萬轉(zhuǎn)錄本(TPM)。

NovaSeq X Plus 和NovaSeq 6000基因測序儀的總 RNA-Seq數(shù)據(jù)質(zhì)量(表5)和mRNA-Seq 數(shù)據(jù)質(zhì)量(表6)均高于已公布的規(guī)格。對于總RNA-Seq(圖1)和mRNA-Seq(圖2)，兩個平臺的轉(zhuǎn)錄本定量結果具有出色的一致性(R2 > 0.99)。這些數(shù)據(jù)表明，在NovaSeq X 系列上進行全轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)質(zhì)量達到或超過了NovaSeq 6000基因測序儀的性能。

04

圖3：全基因組甲基化測序——NovaSeq X Plus基因測序儀和NovaSeq 6000 基因測序儀的Zymo-Seq WGBS 結果顯示 (A) 甲基化胞嘧啶百分比和 (B) 比對效率。
 

圖4：全基因組甲基化測序的基因組覆蓋度——NovaSeq X Plus 基因測序儀和NovaSeq 6000 基因測序儀的Zymo-Seq WGBS 結果顯示了CpG 覆蓋度分布。

對全基因組甲基化指標進行評估，從而比較NovaSeq X系列和NovaSeq 6000基因測序儀的性能。NovaSeq X Plus基因測序儀和NovaSeq 6000基因測序儀均展示了甲基化胞嘧啶 百分比的定量數(shù)據(jù)，與基于產(chǎn)品文檔的預期一致(圖3A)。在NovaSeq X Plus基因測序儀上檢測到匹配文庫的比對效率更高(圖3B)。全基因組覆蓋度分布圖顯示，NovaSeq X Plus基因 測序儀和NovaSeq 6000基因測序儀的結果相當，但高覆蓋度 CpG(> 50×)有所增加(圖4)。在文庫制備過程中，亞硫酸氫鹽或酶促轉(zhuǎn)化會將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。這會導致文庫不平衡，這種不平衡歷來都是測序要面對的難題，并且通常需要高比例(> 5%)的 PhiX 來提高堿基多樣性。在NovaSeq X系列上，僅需低比例(1%) 的PhiX即可實現(xiàn)高質(zhì)量的測序運行(表7)。

05

Chromium Single Cell Multiome ATAC+基因表達能以單細胞分辨率聯(lián)合讀出基因表達和表觀遺傳學特征。用于單細胞RNA 測序(scRNA-Seq)和轉(zhuǎn)座酶可及性染色質(zhì)單細胞檢測(scATAC-Seq)的樣本是從AllCells公司提供的健康男性供體(年齡小于35歲)的冷凍保存人外周血單核細胞(PBMC)中聯(lián)合制備的。按照10x Genomics經(jīng)過驗證的實驗方案 —— 單細胞多組學ATAC +基因表達測序的細胞核分離(CG000365 Rev A)中的描述分離細胞核。配對的 scRNA-Seq和scATAC-Seq文庫是從分離的細胞核中生成的，如 Chromium Next GEM單細胞多組學ATAC +基因表達用戶指南(CG000338 Rev B)中所述。使用Cell Ranger ARC analysis pipeline v2.0(10x Genomics)進行數(shù)據(jù)分析以計算單細胞中的轉(zhuǎn)錄本和染色質(zhì)可及性峰值。
 

圖 5: 單細胞多組學基因表達一在NovaSeq X Plus 基因測序儀(藍色)和 NovaSeq 6000 基因測序儀 (紅色) 上測序的 scRNA-Seq文庫的 t-SNE 圖。

圖6：單細胞多組學染色質(zhì)可及性——在NovaSeq X Plus 基因測序儀(藍色) 和NovaSeq 6000 基因測序儀 (紅色) 上測序的 scATAC-Seq文庫的t-SNE圖。

評估了單細胞多組學檢測的性能指標，包括用于測量基因表達的 scRNA-Seq和用于測量染色質(zhì)可及性的scATAC-Seq。NovaSeq X Plus和NovaSeq 6000基因測序儀的數(shù)據(jù)質(zhì)量超過了已公布的規(guī)格要求(表8、表9)。scRNA-Seq基因表達(圖5)和scATAC-Seq染色質(zhì)可及性(圖6)的t-SNE圖顯示NovaSeq X Plus基因測序儀和NovaSeq 6000基因測序儀之間具有良好的相關性。

僅供研究使用，不得用于診斷。