研究結(jié)果
1. 高表達(dá)的ZDHHC21特異性調(diào)控AML細(xì)胞中的OXPHOS活性
首先，我們表征了白血病原始細(xì)胞線粒體ATP的產(chǎn)生，以確認(rèn)AML的生物能量狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)白血病原始細(xì)胞的ATP水平遠(yuǎn)高于正常骨髓細(xì)胞(圖1A )。然后，我們建立了基于ATP的檢測(cè)方法，在AML細(xì)胞而非HSCs中篩選特異性抑制OXPHOS的信號(hào)(圖1B )。如Fig 1C所示，線粒體復(fù)合物I的抑制劑魚藤酮和IACS - 010759確實(shí)顯著抑制AML細(xì)胞( HL60 )中的ATP水平，但也強(qiáng)烈抑制HSCs中的ATP水平。令人興奮的是，在267個(gè)PTM抑制劑中，有16個(gè)化合物選擇性抑制AML細(xì)胞而非HSC細(xì)胞中的OXPHOS，其中ZDHHC棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶家族抑制劑2BP的作用最強(qiáng)。這些結(jié)果表明ZDHHC棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以選擇性地調(diào)節(jié)AML細(xì)胞中的OXPHOS。為了確定哪些ZDHHC可能參與OXPHOS的調(diào)控，我們引入了針對(duì)23個(gè)ZDHHC的siRNA。結(jié)果顯示，只有ZDHHC21選擇性抑制AML細(xì)胞中的ATP水平，而不抑制HSCs中的ATP水平( Fig 1F )。隨后我們發(fā)現(xiàn)，AML細(xì)胞中相對(duì)于正常細(xì)胞上調(diào)最顯著的前3個(gè)ZDHHCs分別是ZDHHC1、ZDHHC21和ZDHHC23(圖1H)。在所有癌種中，ZDHHC21在AML中表達(dá)最高，而ZDHHC1和ZDHHC23在AML中表達(dá)較低(圖1I )，這可能有利于ZDHHC21在AML細(xì)胞中調(diào)控OXPHOS的特異性。
 

2. ZDHHC21激活OXPHOS抑制AML細(xì)胞的髓系分化
為了闡明ZDHHC21在AML進(jìn)展中的遠(yuǎn)程作用，我們進(jìn)行了基因集富集分析( Gene Set Enrichment Analysis，GSEA )，發(fā)現(xiàn)在ZDHHC21高表達(dá)的患者中，通常在HSCs中上調(diào)而在髓系細(xì)胞發(fā)育中下調(diào)的基因高度富集(圖2A )。然后，在shZDHHC21轉(zhuǎn)染的AML細(xì)胞中進(jìn)行RNA測(cè)序，結(jié)果顯示，在第4天和第7天，shZDHHC21引起的693個(gè)改變的基因高度富集在分化相關(guān)和成熟相關(guān)的簇(圖2B)中。sh ZDHHC21細(xì)胞中的差異表達(dá)基因也與HSCs中通常下調(diào)而髓系細(xì)胞發(fā)育中上調(diào)的基因相匹配。這些結(jié)果提示ZDHHC21可能在髓系分化中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步研究ZDHHC21調(diào)控的OXPHOS在髓系分化中的遠(yuǎn)端效應(yīng)，我們分析了ZDHHC21的動(dòng)態(tài)表達(dá)以及OXPHOS水平在HSCs不同成熟階段的變化。如Fig 2C所示，隨著HSCs的分化成熟，ZDHHC21逐漸降低，而在AML細(xì)胞中ZDHHC21持續(xù)高表達(dá)。
 

圖2

3. ZDHHC21調(diào)控LSCs的干性潛能和AML細(xì)胞的化療耐藥
shZDHHC21顯著抑制LSCs的增殖和克隆形成能力，而對(duì)HSCs的增殖和克隆形成能力沒有影響。在2BP處理(圖3I - K)后，LSCs中的OXPHOS、細(xì)胞增殖和集落形成能力也觀察到類似的選擇性抑制作用，而HSCs中沒有觀察到類似的選擇性抑制作用。這些結(jié)果表明，ZDHHC21缺失/抑制顯著削弱了LSCs的干性潛能，且靶向ZDHHC21對(duì)HSCs的毒性最小。更重要的是，高OXPHOS的初治AML樣本對(duì)化療敏感性較差，包括標(biāo)準(zhǔn)治療藥物阿糖胞苷和阿霉素，以及其他化療藥物。
 

圖3

4. ZDHHC21誘導(dǎo)的AML增殖、干性和分化阻滯依賴于其棕櫚酰�；�轉(zhuǎn)移酶活性
作為一種棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶，我們想知道ZDHHC21對(duì)AML惡性進(jìn)展的調(diào)控作用是否依賴于其酶活性。首先，我們構(gòu)建了小鼠ZDHHC21 ( mZDHHC21 )及其催化失活突變體( C120S )，并在ZDHHC21敲低的細(xì)胞中重新表達(dá)(圖4A )。如預(yù)期的那樣，sh ZDHHC21明顯抑制了AML細(xì)胞的增殖，m ZDHHC21過表達(dá)而非m ZDHHC21 ( C120S )挽救了sh ZDHHC21誘導(dǎo)的(圖4B)表型。此外，過表達(dá)mZDHHC21可以恢復(fù)shZDHHC21抑制的AML細(xì)胞在軟瓊脂中的克隆形成能力，但不能恢復(fù)mZDHHC21 ( C120S ) (圖4C)的克隆形成能力。更重要的是，我們確定了這些細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，sh ZDHHC21明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，m ZDHHC21過表達(dá)可以挽救sh ZDHHC21對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，而m ZDHHC21 ( C120S ) (圖4F - G)不能挽救sh ZDHHC21對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。因此，這些結(jié)果表明ZDHHC21的棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性是其在AML細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控功能所必需的

圖4

5. shZDHHC21在AML中表現(xiàn)出較強(qiáng)的治療作用，并延長(zhǎng)白血病小鼠的生存期，靶向ZDHHC21是復(fù)發(fā)/難治AML的潛在治療策略
我們首先將HL60 - shCtrl或HL60 - shZDHHC21細(xì)胞靜脈移植到NOD/SCID小鼠中。shZDHHC21顯著抑制了白血病總體負(fù)荷(圖5A和S20A)和因白血病發(fā)生導(dǎo)致的體重下降(圖5B )。與shCtrl細(xì)胞相比，shZDHHC21細(xì)胞移植組小鼠的總生存期顯著延長(zhǎng)( Fig 5C )。接下來，我們?cè)贖L60皮下移植瘤小鼠模型中評(píng)估了ZDHHC21抑制的抗腫瘤活性。shZDHHC21 -慢病毒顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低腫瘤重量(圖5D - E)。shZDHHC21顯示出明顯的治療活性，沒有觀察到明顯的體重下降。此外，與shCtrl組相比，HL60 - shZDHHC21細(xì)胞移植瘤中CD11b和CD14表達(dá)上調(diào)(圖5F )。
 

圖5

由于ZDHHC21可以調(diào)節(jié)LSC的維持和化療耐藥，我們想知道靶向ZDHHC21是否可以治療復(fù)發(fā)/難治性AML。首先，我們?cè)趶?fù)發(fā)/難治的PDX - AML移植瘤模型中評(píng)估了ZDHHC21抑制的效果。從攜帶FLT3ITD的復(fù)發(fā)/難治AML患者中分離AML原始細(xì)胞，將sh Ctrl或sh ZDHHC21慢病毒感染的原始細(xì)胞移植到NSG小鼠體內(nèi)。感染sh Ctrl病毒的囊胚移植28 d后，由于白血病的發(fā)生，體重減輕明顯，而sh ZDHHC21組則沒有(圖6A )。值得注意的是，shZDHHC21組的總生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(圖6B )。與此一致，sh ZDHHC21組表現(xiàn)出更低的白血病植入水平(圖6C )和更低的脾臟重量(圖67D )。此外，從脾臟中提取的細(xì)胞顯示CD34+細(xì)胞比例細(xì)胞減少，sh ZDHHC21組白血病細(xì)胞CD11b表達(dá)高于s組，為了進(jìn)一步證實(shí)2BP在臨床上對(duì)化療的潛在增敏作用，我們從3例藥物敏感和3例難治患者中分離出原代AML原始細(xì)胞。與藥物敏感樣品相比，2BP顯著增強(qiáng)Ara - C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)難治細(xì)胞對(duì)Ara - C的再敏化。此外，2BP還增強(qiáng)Ara - C誘導(dǎo)的LSCs凋亡�？傊�，這些結(jié)果強(qiáng)烈表明ZDHHC21是復(fù)發(fā)/難治性AML的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。

圖6

綜上所述，該研究揭示了棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶ZDHHC21調(diào)控AML特別是LSC細(xì)胞線粒體氧化磷酸化的全新生物學(xué)功能，也提出抑制ZDHHC21作為兒童AML尤其是復(fù)發(fā)/難治患兒的潛在治療策略，為兒童白血病的臨床治療提供全新藥物靶點(diǎn)和思路。

參考文獻(xiàn)：
Shao X, Xu A, Du W, Xu T, Huang Y, Xia Z, Wang W, Cai M, Zhang X, Zhang J, Cao J, Xu X, Yang B, He Q, Ying M. The palmitoyltransferase ZDHHC21 regulates oxidative phosphorylation to induce differentiation block and stemness in AML. Blood. 2023 Jul 27;142(4):365-381. doi: 10.1182/blood.2022019056. PMID: 37216691.