MeRIP-seq等揭示ALKBH5介導(dǎo)m6A去甲基化調(diào)控皮膚創(chuàng)面再上皮化分子機(jī)制
哺乳動(dòng)物的損傷皮膚屏障完整性恢復(fù)通過(guò)創(chuàng)面愈合基本機(jī)制實(shí)現(xiàn)，這是一個(gè)包括凝血、炎癥、再上皮化（re-epithelialization）、肉芽組織形成和疤痕重塑的多步驟過(guò)程。再上皮化是決定創(chuàng)面成功愈合的重要因素，再上皮化受損是創(chuàng)傷、糖尿病、血管疾病、感染或輻射導(dǎo)致的所有慢性創(chuàng)面無(wú)法愈合的原因。因此研究創(chuàng)面再上皮化調(diào)控機(jī)制具有重要的臨床意義，并可能為加速創(chuàng)面愈合的治療策略提供新的見(jiàn)解。
N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最普遍的內(nèi)部mRNA修飾，哺乳動(dòng)物m6A修飾受“writers”（如METTL3、METTL14、WTAP）和“erasers”（如FTO、ALKBH5））的動(dòng)態(tài)和可逆調(diào)控。同時(shí)m6A修飾可以被特異性RNA結(jié)合蛋白識(shí)別（稱(chēng)為“readers”，如YTHDF1-3、HNRNP、IGF2BP）。m6A修飾被“readers”蛋白識(shí)別后，可以影響RNA代謝的各個(gè)方面，包括RNA穩(wěn)定性、翻譯、剪接、易位和高級(jí)結(jié)構(gòu)。近年來(lái)大量研究表明m6A修飾廣泛參與毛囊形態(tài)發(fā)生、紫外線(xiàn)介導(dǎo)的皮膚損傷、系統(tǒng)性硬化、尋常型銀屑病、增生性瘢痕和腫瘤發(fā)生的調(diào)控。同時(shí)，m6A修飾在創(chuàng)面愈合過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，然而m6A修飾是否在調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移能力中發(fā)揮作用仍不清楚。此外對(duì)m6A修飾在創(chuàng)面再上皮化中的作用缺乏全面了解。
2023年7月14日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科Xin Huang、Yixuan Zhao、湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院創(chuàng)面修復(fù)科劉代明為共同第一作者，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科昝濤、李青峰、Yixuan Zhao為共同通訊作者， 以“ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability”為題在《Inflammation and Regeneration》雜志發(fā)表研究論文，該研究通過(guò)甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）和對(duì)應(yīng)的RNA-seq聯(lián)合分析揭示了ALKBH5是創(chuàng)面再上皮化的內(nèi)源性促進(jìn)因子，提示了開(kāi)發(fā)針對(duì)難治性創(chuàng)面的重編程m6A靶向療法的前景。
標(biāo)題：ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability（ALKBH5介導(dǎo)的m6A去甲基化通過(guò)增強(qiáng) PELI2 mRNA 穩(wěn)定性促進(jìn)皮膚創(chuàng)面再上皮化）
時(shí)間：2023-07-14
期刊：Inflammation and Regeneration
影響因子：IF 8.1
技術(shù)平臺(tái)：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq、m6A-RIP-qPCR 、qRT-PCR、Dot-blot、WB/IF等
研究摘要：
創(chuàng)面再上皮化受損會(huì)導(dǎo)致皮膚屏障重建功能障礙。m6A RNA修飾參與RNA命運(yùn)決定，m6A甲基化變異會(huì)觸發(fā)許多疾病發(fā)病機(jī)制。然而，m6A在創(chuàng)面再上皮化中的作用仍然未知。本研究構(gòu)建ALKBH5-/-小鼠以研究ALKBH5敲除后創(chuàng)面再上皮化率。采用甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）和RNA-seq結(jié)合的高通量測(cè)序分析方法鑒定出ALKBH5的下游靶標(biāo)。通過(guò)體外和體內(nèi)挽救實(shí)驗(yàn)（In vitro and in vivo rescue experiments）驗(yàn)證下游靶標(biāo)對(duì)ALKBH5缺失細(xì)胞或動(dòng)物的功能表型作用。此外，通過(guò)RIP-qPCR、RNA下拉和RNA穩(wěn)定性分析揭示了互作的reader蛋白和調(diào)控機(jī)制。
研究結(jié)果表明，ALKBH5在創(chuàng)緣表皮中特異性上調(diào)。ALKBH5敲除抑制了ALKBH5-/-小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocytes）遷移，并導(dǎo)致創(chuàng)面再上皮化延遲。綜合高通量分析揭示E3泛素蛋白連接酶PELI2是ALKBH5的下游靶標(biāo)。體外和體內(nèi)挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源性PELI2補(bǔ)充可以在體內(nèi)和體外部分挽救ALKBH5缺失細(xì)胞中的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移并加速再上皮化。從機(jī)制上來(lái)說(shuō)，ALKBH5通過(guò)去除PELI2 mRNA中的m6A修飾來(lái)促進(jìn)PELI2表達(dá)，并以YTHDF2依賴(lài)的方式增強(qiáng)其穩(wěn)定性。
圖形摘要
研究結(jié)果
（1）在創(chuàng)緣的角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocytes）中觀(guān)察到RNA m6A修飾減少和ALKBH5表達(dá)增加
圖1：健康創(chuàng)面邊緣角質(zhì)形成細(xì)胞中RNA m6A修飾降低，ALKBH5表達(dá)增加。
a. 在小鼠背部產(chǎn)生直徑5 mm的全層皮膚創(chuàng)面，切除肉脂膜下方筋膜(紅虛線(xiàn))以防止創(chuàng)面收縮。
b. 傷后2 d (PWD2)皮膚創(chuàng)面大體外觀(guān)及組織學(xué)。勾畫(huà)創(chuàng)面床、創(chuàng)緣及鄰近正常皮膚。比例尺:250 μm。
c. m6A-DB分析從創(chuàng)面邊緣皮膚和鄰近正常皮膚提取mRNA的整體m6A水平。亞甲基藍(lán)(Methylene blue)染色法檢測(cè)總RNA(作為loading control)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。t檢驗(yàn)，雙側(cè)*P<0.05。
d.創(chuàng)面邊緣和正常皮膚m6A“writer”和“eraser”基因表達(dá)的熱圖。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)生物重復(fù)。
e.RNA-seq數(shù)據(jù)(GSE159939)繪制的m6A“writer”和“eraser”基因在創(chuàng)床和創(chuàng)緣表皮和真皮中的表達(dá)熱圖。
f. IF檢測(cè)創(chuàng)緣皮膚ALKBH5表達(dá)。比例尺:100 μm。
g.統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)HPF中ALKBH5角質(zhì)形成細(xì)胞的百分比。取4只小鼠創(chuàng)面樣本，ALKBH5細(xì)胞百分比以均數(shù)±SD表示。t檢驗(yàn)，雙側(cè)***P<0.001。
h.代表性臨床照片，顯示了一組以愈合或難治性不愈合創(chuàng)面為特征的慢性創(chuàng)面患者隊(duì)列。
i. IF檢測(cè)愈合創(chuàng)面、難愈創(chuàng)面及正常皮膚創(chuàng)面邊緣ALKBH5的表達(dá)。比例尺:100 μm。
j.統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)HPF中ALKBH5表皮細(xì)胞的百分比。分析4例愈合創(chuàng)面、6例難愈創(chuàng)面的創(chuàng)緣及相應(yīng)的正常皮膚對(duì)照。ALKBH5細(xì)胞的百分比表示為平均值±SD。單因素方差分析，***P < 0.001。Epi表皮。虛線(xiàn)表示表皮邊界++++
（2）ALKBH5抑制降低角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移
c. 從ALKBH5敲低組和對(duì)照組的HaCaT細(xì)胞中提取RNA，通過(guò)m6A-DB檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后的整體m6A水平。亞甲基藍(lán)染色法檢測(cè)總RNA(作為對(duì)照)。
d. Transwell實(shí)驗(yàn)分析ALKBH5敲低組和對(duì)照組HaCaT細(xì)胞的遷移能力。比例尺:25 μm。
e. Transwell實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，共納入5個(gè)隨機(jī)字段進(jìn)行分析。遷移細(xì)胞面積的百分比用平均值±SD表示。單因素方差分析，***P < 0.001。
f. 采用細(xì)胞跟蹤成像技術(shù)繪制ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)后0 h、2 h、16 h、32 h的代表性動(dòng)態(tài)細(xì)胞速度圖。x方向速度為u, y方向速度為v。速度大小表示u和v的合成速度，速度的方向和大小分別用黑色箭頭和顏色密度表示。FC相位對(duì)比圖像。比例尺:250 μm。
g. 不同時(shí)間點(diǎn)ALKBH5敲低組和對(duì)照組HaCaT細(xì)胞的速度大小的統(tǒng)計(jì)分析。
h. 統(tǒng)計(jì)分析劃痕創(chuàng)面愈合率。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
i. 通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估HaCaT細(xì)胞的長(zhǎng)期遷移能力。比例尺:100 μm。
j. 創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)納入3個(gè)隨機(jī)字段進(jìn)行分析。單因素方差分析，***P < 0.001
（3）ALKBH5敲除可抑制小鼠創(chuàng)面再上皮化
b-c. WB (b)和IF (c)分別證實(shí)ALKBH5-/-小鼠皮膚和表皮中ALKBH5表達(dá)缺失。
d. m6A-DB分析WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)面邊緣皮膚的整體m6A水平。亞甲基藍(lán)染色法檢測(cè)總RNA(作為裝載對(duì)照)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，m6A修飾的相對(duì)含量以平均值±SD表示。t檢驗(yàn)，雙側(cè)*P<0.05。
e. IF分析揭示ALKBH5 -/-小鼠創(chuàng)面邊緣表皮中ALKBH5表達(dá)缺失。比例尺:100 μm。虛線(xiàn)表示表皮邊界。Epi表皮。
f-g. WT和ALKBH5-/-小鼠在PWD0、PWD2、PWD4、PWD6、PWD8上的皮膚創(chuàng)面代表性圖像(f)。比例尺:2 mm。黑色虛線(xiàn)圓描繪了5mm寬的原始創(chuàng)面。創(chuàng)面閉合率(g)通過(guò)ImageJ軟件進(jìn)行量化，并表示為不愈合區(qū)域的百分比。6只小鼠的12個(gè)創(chuàng)面納入分析。創(chuàng)面閉合的相對(duì)百分比以平均值±SD表示。t檢驗(yàn)，雙側(cè)**P<0.01， ***P<0.001。
h-i. PWD8時(shí)WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)面再上皮化的組織學(xué)分析(h)。箭頭線(xiàn)表示原創(chuàng)面間隙寬度為5 mm。鈍端線(xiàn)描繪上皮間隙，代表非上皮化的創(chuàng)面區(qū)域。比例尺:1mm。在PWD8時(shí)對(duì)WT和ALKBH5-/-小鼠的再上皮化百分比進(jìn)行定量分析(i)。6只小鼠的12個(gè)創(chuàng)面納入分析。再上皮化創(chuàng)面面積的相對(duì)百分比以均數(shù)±SD表示。Mann-Whitney檢驗(yàn)，雙側(cè)****P< 0.0001。比例尺:1mm。虛線(xiàn)表示表皮邊界
（4）全基因組MeRIP-seq和RNA-seq鑒定出PELI2是ALKBH5的下游靶標(biāo)
圖4：在人表皮樣本和角質(zhì)形成細(xì)胞系中受ALKBH5調(diào)控的m6A修飾基因表征
a. m6A修飾下游分析流程圖。MeRIP-seq鑒定出人類(lèi)表皮樣本和角質(zhì)形成細(xì)胞系共有的3710個(gè)基因，在3'UTR中具有特異性m6A peaks。RNA-seq在 ALKBH5敲低后鑒定出306個(gè)下調(diào)基因；以|FC|<0.5和P <0.05定義為差異表達(dá)基因。FC fold change。最終鑒定出16個(gè)同時(shí)具有m6A peaks和差異表達(dá)候選基因作為ALKBH5的潛在下游靶點(diǎn)。
b. 3710個(gè)共有基因的GO富集分析圖譜。
c. 由IPA產(chǎn)生的PELI2和其他15個(gè)候選基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。未顯示C3orf33、PGBD2、ZNF20、ZNF573、ZNF577和ZNF785基因，因?yàn)樗鼈兣cPELI2沒(méi)有通路連接。
d. qRT-PCR檢測(cè)ALKBH5敲低后16個(gè)候選基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，mRNA的相對(duì)表達(dá)量以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05;** p<0.01。
e. IGV軌跡顯示人表皮和HaCaT中PELI2的MeRIP-seq reads覆蓋。
f. m6A-RIP-qPCR檢測(cè)證實(shí)PELI2轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。將抗m6A抗體組和IgG組的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較，以均數(shù)±SD表示。單因素方差分析，**P<0.01
(5) ALKBH5調(diào)控m6A甲基化和PELI2表達(dá)
b. WB敲低ALKBH5后，檢測(cè)HaCaT細(xì)胞PELI2蛋白表達(dá)。
c. 通過(guò)IF染色分析PWD8中的WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣皮膚PELI2表達(dá)。虛線(xiàn)表示表皮邊界。比例尺:100 μm。
d. qRT-PCR顯示PELI2在WT和ALKBH5-/-小鼠原代角質(zhì)形成細(xì)胞中的mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，mRNA相對(duì)表達(dá)量以平均值±SD表示。t檢驗(yàn)，雙側(cè)**P<0.01。
e. 采用IF染色分析PWD6時(shí)WT小鼠創(chuàng)緣表皮PELI2和ALKBH5的表達(dá)及共定位情況。比例尺:100 μm。
f. IGV軌跡顯示ALKBH5敲低后PELI2的MeRIP-seq reads覆蓋情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。
g. 通過(guò)基因特異性m6A-RIP-qPCR檢測(cè)HACAT細(xì)胞中ALKBH5敲低后PELI2轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾增加。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將每組mRNA的相對(duì)表達(dá)量與input值進(jìn)行比較，以平均值±SD表示。單因素方差分析，ns不顯著，*P<0.05，****P<0.0001
（6）外源性PELI2過(guò)表達(dá)可挽救ALKBH5缺失后延遲的創(chuàng)面再上皮化
c. WB檢測(cè)ALKBH5和PELI2的蛋白表達(dá)。
d. Transwell實(shí)驗(yàn)顯示外源性PELI2過(guò)表達(dá)對(duì)ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細(xì)胞遷移的影響。比例尺:25 μm。
e. 對(duì)Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，共納入5個(gè)隨機(jī)字段進(jìn)行分析。遷移細(xì)胞的百分比面積表示為平均值±SD。單因素方差分析，***P<0.001。比例尺:25 μm。
f. 采用劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估外源性PELI2過(guò)表達(dá)對(duì)ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細(xì)胞遷移的影響。比例尺:100 μm。
g.創(chuàng)面劃痕實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的3個(gè)隨機(jī)字段納入分析。Mann-Whitney檢驗(yàn)(24 h)， ALKBH5-si1 + p-PELI2組與ALKBH5-si1 + p-NC組、ALKBH5-si2 + p-PELI2組與ALKBH5-si2 + p-NC組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。單因素方差分析(48 h, 72 h)，***P<0.001
b. qRT-PCR證實(shí)ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣皮膚PELI2 mRNA表達(dá)恢復(fù)。5只小鼠的5個(gè)創(chuàng)面納入分析�；虻南鄬�(duì)表達(dá)水平以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
c. IF分析證實(shí)Lv-PELI2轉(zhuǎn)染后ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣表皮PELI2表達(dá)恢復(fù)。虛線(xiàn)表示表皮邊界。Epi表皮。比例尺:25 μm。
d-e. Lv-NC轉(zhuǎn)染的WT小鼠以及Lv-PELI2或Lv-NC轉(zhuǎn)染的ALKBH5-/-小鼠在PWD0、PWD2、PWD4、PWD6、PWD8的皮膚創(chuàng)面代表性圖像。比例尺:2mm。黑色虛線(xiàn)圓圈繪制了5 mm寬的原始創(chuàng)面。采用ImageJ軟件對(duì)創(chuàng)面閉合率(e)進(jìn)行量化，e表示為創(chuàng)面未愈合面積的百分比。5只小鼠的10個(gè)創(chuàng)面納入分析。創(chuàng)面閉合的相對(duì)百分比以平均值±SD表示。單因素方差分析(第2天，第4天，第6天)，***P < 0.001。Mann-Whitney檢驗(yàn)(第8天)，雙側(cè)*P< 0.05 (KO + Lv-PELI2 vs. KO + Lv-NC)。
f-g. 用Lv-NC轉(zhuǎn)染的WT小鼠和用Lv-PELI2或Lv-NC轉(zhuǎn)染的ALKBH5-/-小鼠在劃痕實(shí)驗(yàn)后第8天的創(chuàng)面再上皮化組織學(xué)分析(f)。箭頭線(xiàn)表示原創(chuàng)面間隙寬度為5mm。鈍端線(xiàn)描繪了上皮間隙，表示非上皮化創(chuàng)面寬度。再上皮化百分比定量(g)。5只小鼠的10個(gè)創(chuàng)面納入分析。再上皮化創(chuàng)面的相對(duì)百分比以均數(shù)±SD表示。Mann-Whitney檢驗(yàn)，雙側(cè)**P<0.01,****P<0.0001。虛線(xiàn)表示表皮邊界。比例尺:200 μm
（7）ALKBH5以YTHDF2依賴(lài)性方式穩(wěn)定PELI2 mRNA表達(dá)
b. 用于RNA下拉分析的RNA探針示意圖。
c. 使用帶有或不帶有m6A修飾的PELI2 RNA探針，從細(xì)胞提取物中RNA下拉內(nèi)源性YTHDF2蛋白。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
d-e. 通過(guò)qRT-PCR (d)和WB (e)評(píng)估ALKBH5和YTHDF2敲低組或?qū)φ战MHaCaT細(xì)胞中的PELI2表達(dá)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。對(duì)PELI2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，并以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
f. 用放線(xiàn)菌素D (5 μg/mL)處理ALKBH5和YTHDF2敲除或?qū)φ誋aCaT細(xì)胞0h、2 h、4 h、6 h、8 h， qRT-PCR分析PELI2的mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
g. m6A eraser蛋白ALKBH5上調(diào)介導(dǎo)m6A甲基化降低如何通過(guò)YTHDF2依賴(lài)性方式增強(qiáng)PELI2 mRNA的穩(wěn)定性來(lái)促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化示意圖
研究結(jié)論
本研究通過(guò)MeRIP-seq和對(duì)應(yīng)的RNA-seq等分析揭示了創(chuàng)面再上皮化的一種新機(jī)制，通過(guò)該機(jī)制，m6A eraser蛋白ALKBH5在創(chuàng)緣被特異性激活，并通過(guò)從PELI2 mRNA中去除m6A位點(diǎn)并保護(hù)其免受YTHDF2介導(dǎo)的降解來(lái)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移。本研究從RNA表觀(guān)轉(zhuǎn)錄組調(diào)控角度拓展了對(duì)創(chuàng)面再上皮化的理解。重要的是，ALKBH5和PELI2可能是開(kāi)發(fā)針對(duì)難愈性創(chuàng)面患者的重編程m6A靶向治療的潛在治療靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
Huang X, Zhao Y, Liu D, Gu S, Liu Y, Khoong Y, Luo S, Zhang Z, Xia W, Wang M, Liang H, Li M, Li Q, Zan T. ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability. Inflamm Regen. 2023 Jul 14;43(1):36.
N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最普遍的內(nèi)部mRNA修飾，哺乳動(dòng)物m6A修飾受“writers”（如METTL3、METTL14、WTAP）和“erasers”（如FTO、ALKBH5））的動(dòng)態(tài)和可逆調(diào)控。同時(shí)m6A修飾可以被特異性RNA結(jié)合蛋白識(shí)別（稱(chēng)為“readers”，如YTHDF1-3、HNRNP、IGF2BP）。m6A修飾被“readers”蛋白識(shí)別后，可以影響RNA代謝的各個(gè)方面，包括RNA穩(wěn)定性、翻譯、剪接、易位和高級(jí)結(jié)構(gòu)。近年來(lái)大量研究表明m6A修飾廣泛參與毛囊形態(tài)發(fā)生、紫外線(xiàn)介導(dǎo)的皮膚損傷、系統(tǒng)性硬化、尋常型銀屑病、增生性瘢痕和腫瘤發(fā)生的調(diào)控。同時(shí)，m6A修飾在創(chuàng)面愈合過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，然而m6A修飾是否在調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移能力中發(fā)揮作用仍不清楚。此外對(duì)m6A修飾在創(chuàng)面再上皮化中的作用缺乏全面了解。
2023年7月14日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科Xin Huang、Yixuan Zhao、湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院創(chuàng)面修復(fù)科劉代明為共同第一作者，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科昝濤、李青峰、Yixuan Zhao為共同通訊作者， 以“ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability”為題在《Inflammation and Regeneration》雜志發(fā)表研究論文，該研究通過(guò)甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）和對(duì)應(yīng)的RNA-seq聯(lián)合分析揭示了ALKBH5是創(chuàng)面再上皮化的內(nèi)源性促進(jìn)因子，提示了開(kāi)發(fā)針對(duì)難治性創(chuàng)面的重編程m6A靶向療法的前景。
時(shí)間：2023-07-14
期刊：Inflammation and Regeneration
影響因子：IF 8.1
技術(shù)平臺(tái)：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq、m6A-RIP-qPCR 、qRT-PCR、Dot-blot、WB/IF等
研究摘要：
創(chuàng)面再上皮化受損會(huì)導(dǎo)致皮膚屏障重建功能障礙。m6A RNA修飾參與RNA命運(yùn)決定，m6A甲基化變異會(huì)觸發(fā)許多疾病發(fā)病機(jī)制。然而，m6A在創(chuàng)面再上皮化中的作用仍然未知。本研究構(gòu)建ALKBH5-/-小鼠以研究ALKBH5敲除后創(chuàng)面再上皮化率。采用甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）和RNA-seq結(jié)合的高通量測(cè)序分析方法鑒定出ALKBH5的下游靶標(biāo)。通過(guò)體外和體內(nèi)挽救實(shí)驗(yàn)（In vitro and in vivo rescue experiments）驗(yàn)證下游靶標(biāo)對(duì)ALKBH5缺失細(xì)胞或動(dòng)物的功能表型作用。此外，通過(guò)RIP-qPCR、RNA下拉和RNA穩(wěn)定性分析揭示了互作的reader蛋白和調(diào)控機(jī)制。
研究結(jié)果表明，ALKBH5在創(chuàng)緣表皮中特異性上調(diào)。ALKBH5敲除抑制了ALKBH5-/-小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocytes）遷移，并導(dǎo)致創(chuàng)面再上皮化延遲。綜合高通量分析揭示E3泛素蛋白連接酶PELI2是ALKBH5的下游靶標(biāo)。體外和體內(nèi)挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源性PELI2補(bǔ)充可以在體內(nèi)和體外部分挽救ALKBH5缺失細(xì)胞中的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移并加速再上皮化。從機(jī)制上來(lái)說(shuō)，ALKBH5通過(guò)去除PELI2 mRNA中的m6A修飾來(lái)促進(jìn)PELI2表達(dá)，并以YTHDF2依賴(lài)的方式增強(qiáng)其穩(wěn)定性。
圖形摘要
研究結(jié)果
（1）在創(chuàng)緣的角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocytes）中觀(guān)察到RNA m6A修飾減少和ALKBH5表達(dá)增加
圖1：健康創(chuàng)面邊緣角質(zhì)形成細(xì)胞中RNA m6A修飾降低，ALKBH5表達(dá)增加。
b. 傷后2 d (PWD2)皮膚創(chuàng)面大體外觀(guān)及組織學(xué)。勾畫(huà)創(chuàng)面床、創(chuàng)緣及鄰近正常皮膚。比例尺:250 μm。
c. m6A-DB分析從創(chuàng)面邊緣皮膚和鄰近正常皮膚提取mRNA的整體m6A水平。亞甲基藍(lán)(Methylene blue)染色法檢測(cè)總RNA(作為loading control)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。t檢驗(yàn)，雙側(cè)*P<0.05。
d.創(chuàng)面邊緣和正常皮膚m6A“writer”和“eraser”基因表達(dá)的熱圖。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)生物重復(fù)。
e.RNA-seq數(shù)據(jù)(GSE159939)繪制的m6A“writer”和“eraser”基因在創(chuàng)床和創(chuàng)緣表皮和真皮中的表達(dá)熱圖。
f. IF檢測(cè)創(chuàng)緣皮膚ALKBH5表達(dá)。比例尺:100 μm。
g.統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)HPF中ALKBH5角質(zhì)形成細(xì)胞的百分比。取4只小鼠創(chuàng)面樣本，ALKBH5細(xì)胞百分比以均數(shù)±SD表示。t檢驗(yàn)，雙側(cè)***P<0.001。
h.代表性臨床照片，顯示了一組以愈合或難治性不愈合創(chuàng)面為特征的慢性創(chuàng)面患者隊(duì)列。
i. IF檢測(cè)愈合創(chuàng)面、難愈創(chuàng)面及正常皮膚創(chuàng)面邊緣ALKBH5的表達(dá)。比例尺:100 μm。
j.統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)HPF中ALKBH5表皮細(xì)胞的百分比。分析4例愈合創(chuàng)面、6例難愈創(chuàng)面的創(chuàng)緣及相應(yīng)的正常皮膚對(duì)照。ALKBH5細(xì)胞的百分比表示為平均值±SD。單因素方差分析，***P < 0.001。Epi表皮。虛線(xiàn)表示表皮邊界++++
（2）ALKBH5抑制降低角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移
圖2：抑制ALKBH5可在體外破壞角質(zhì)形成細(xì)胞遷移。
a-b. 通過(guò)qRT-PCR (a)和WB (b)驗(yàn)證，siRNA轉(zhuǎn)染后，HaCaT細(xì)胞中的ALKBH5表達(dá)降低。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。單因素方差分析 ***P < 0.001。c. 從ALKBH5敲低組和對(duì)照組的HaCaT細(xì)胞中提取RNA，通過(guò)m6A-DB檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后的整體m6A水平。亞甲基藍(lán)染色法檢測(cè)總RNA(作為對(duì)照)。
d. Transwell實(shí)驗(yàn)分析ALKBH5敲低組和對(duì)照組HaCaT細(xì)胞的遷移能力。比例尺:25 μm。
e. Transwell實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，共納入5個(gè)隨機(jī)字段進(jìn)行分析。遷移細(xì)胞面積的百分比用平均值±SD表示。單因素方差分析，***P < 0.001。
f. 采用細(xì)胞跟蹤成像技術(shù)繪制ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)后0 h、2 h、16 h、32 h的代表性動(dòng)態(tài)細(xì)胞速度圖。x方向速度為u, y方向速度為v。速度大小表示u和v的合成速度，速度的方向和大小分別用黑色箭頭和顏色密度表示。FC相位對(duì)比圖像。比例尺:250 μm。
g. 不同時(shí)間點(diǎn)ALKBH5敲低組和對(duì)照組HaCaT細(xì)胞的速度大小的統(tǒng)計(jì)分析。
h. 統(tǒng)計(jì)分析劃痕創(chuàng)面愈合率。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
i. 通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估HaCaT細(xì)胞的長(zhǎng)期遷移能力。比例尺:100 μm。
j. 創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)納入3個(gè)隨機(jī)字段進(jìn)行分析。單因素方差分析，***P < 0.001
（3）ALKBH5敲除可抑制小鼠創(chuàng)面再上皮化
圖3：ALKBH5缺失會(huì)抑制小鼠創(chuàng)面的再上皮化。
a .使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除ALKBH5基因的策略示意圖。b-c. WB (b)和IF (c)分別證實(shí)ALKBH5-/-小鼠皮膚和表皮中ALKBH5表達(dá)缺失。
d. m6A-DB分析WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)面邊緣皮膚的整體m6A水平。亞甲基藍(lán)染色法檢測(cè)總RNA(作為裝載對(duì)照)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，m6A修飾的相對(duì)含量以平均值±SD表示。t檢驗(yàn)，雙側(cè)*P<0.05。
e. IF分析揭示ALKBH5 -/-小鼠創(chuàng)面邊緣表皮中ALKBH5表達(dá)缺失。比例尺:100 μm。虛線(xiàn)表示表皮邊界。Epi表皮。
f-g. WT和ALKBH5-/-小鼠在PWD0、PWD2、PWD4、PWD6、PWD8上的皮膚創(chuàng)面代表性圖像(f)。比例尺:2 mm。黑色虛線(xiàn)圓描繪了5mm寬的原始創(chuàng)面。創(chuàng)面閉合率(g)通過(guò)ImageJ軟件進(jìn)行量化，并表示為不愈合區(qū)域的百分比。6只小鼠的12個(gè)創(chuàng)面納入分析。創(chuàng)面閉合的相對(duì)百分比以平均值±SD表示。t檢驗(yàn)，雙側(cè)**P<0.01， ***P<0.001。
h-i. PWD8時(shí)WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)面再上皮化的組織學(xué)分析(h)。箭頭線(xiàn)表示原創(chuàng)面間隙寬度為5 mm。鈍端線(xiàn)描繪上皮間隙，代表非上皮化的創(chuàng)面區(qū)域。比例尺:1mm。在PWD8時(shí)對(duì)WT和ALKBH5-/-小鼠的再上皮化百分比進(jìn)行定量分析(i)。6只小鼠的12個(gè)創(chuàng)面納入分析。再上皮化創(chuàng)面面積的相對(duì)百分比以均數(shù)±SD表示。Mann-Whitney檢驗(yàn)，雙側(cè)****P< 0.0001。比例尺:1mm。虛線(xiàn)表示表皮邊界
（4）全基因組MeRIP-seq和RNA-seq鑒定出PELI2是ALKBH5的下游靶標(biāo)
圖4：在人表皮樣本和角質(zhì)形成細(xì)胞系中受ALKBH5調(diào)控的m6A修飾基因表征
b. 3710個(gè)共有基因的GO富集分析圖譜。
c. 由IPA產(chǎn)生的PELI2和其他15個(gè)候選基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。未顯示C3orf33、PGBD2、ZNF20、ZNF573、ZNF577和ZNF785基因，因?yàn)樗鼈兣cPELI2沒(méi)有通路連接。
d. qRT-PCR檢測(cè)ALKBH5敲低后16個(gè)候選基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，mRNA的相對(duì)表達(dá)量以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05;** p<0.01。
e. IGV軌跡顯示人表皮和HaCaT中PELI2的MeRIP-seq reads覆蓋。
f. m6A-RIP-qPCR檢測(cè)證實(shí)PELI2轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。將抗m6A抗體組和IgG組的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較，以均數(shù)±SD表示。單因素方差分析，**P<0.01
(5) ALKBH5調(diào)控m6A甲基化和PELI2表達(dá)
圖5：ALKBH5表達(dá)水平與PELI2表達(dá)水平呈正相關(guān)。
a. 根據(jù)ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細(xì)胞的RNA-seq分析，IGV追蹤PELI2表達(dá)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)重復(fù)。b. WB敲低ALKBH5后，檢測(cè)HaCaT細(xì)胞PELI2蛋白表達(dá)。
c. 通過(guò)IF染色分析PWD8中的WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣皮膚PELI2表達(dá)。虛線(xiàn)表示表皮邊界。比例尺:100 μm。
d. qRT-PCR顯示PELI2在WT和ALKBH5-/-小鼠原代角質(zhì)形成細(xì)胞中的mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，mRNA相對(duì)表達(dá)量以平均值±SD表示。t檢驗(yàn)，雙側(cè)**P<0.01。
e. 采用IF染色分析PWD6時(shí)WT小鼠創(chuàng)緣表皮PELI2和ALKBH5的表達(dá)及共定位情況。比例尺:100 μm。
f. IGV軌跡顯示ALKBH5敲低后PELI2的MeRIP-seq reads覆蓋情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。
g. 通過(guò)基因特異性m6A-RIP-qPCR檢測(cè)HACAT細(xì)胞中ALKBH5敲低后PELI2轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾增加。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將每組mRNA的相對(duì)表達(dá)量與input值進(jìn)行比較，以平均值±SD表示。單因素方差分析，ns不顯著，*P<0.05，****P<0.0001
（6）外源性PELI2過(guò)表達(dá)可挽救ALKBH5缺失后延遲的創(chuàng)面再上皮化
圖6：外源性PELI2過(guò)表達(dá)挽救了ALKBH5敲低對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的影響。
a-b. qRT-PCR顯示在用ALKBH5或NC siRNA處理并用PELI2或NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后的HaCaT細(xì)胞中PELI2（a）和ALKBH5（b）的mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，mRNA的相對(duì)表達(dá)量以平均值±SD表示。單因素方差分析，ns不顯著，*P<0.05，****P<0.0001。c. WB檢測(cè)ALKBH5和PELI2的蛋白表達(dá)。
d. Transwell實(shí)驗(yàn)顯示外源性PELI2過(guò)表達(dá)對(duì)ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細(xì)胞遷移的影響。比例尺:25 μm。
e. 對(duì)Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，共納入5個(gè)隨機(jī)字段進(jìn)行分析。遷移細(xì)胞的百分比面積表示為平均值±SD。單因素方差分析，***P<0.001。比例尺:25 μm。
f. 采用劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估外源性PELI2過(guò)表達(dá)對(duì)ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細(xì)胞遷移的影響。比例尺:100 μm。
g.創(chuàng)面劃痕實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的3個(gè)隨機(jī)字段納入分析。Mann-Whitney檢驗(yàn)(24 h)， ALKBH5-si1 + p-PELI2組與ALKBH5-si1 + p-NC組、ALKBH5-si2 + p-PELI2組與ALKBH5-si2 + p-NC組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。單因素方差分析(48 h, 72 h)，***P<0.001
圖7：外源性PELI2過(guò)表達(dá)挽救了ALKBH5敲低對(duì)再上皮化和創(chuàng)面愈合的影響。
a. 創(chuàng)面建立后d0和d1, WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣皮膚皮內(nèi)注射Lv-PELI2和Lv-NC (1×107 TU/ml, 1% Lipo3000)示意圖。于PWD8時(shí)處死小鼠。b. qRT-PCR證實(shí)ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣皮膚PELI2 mRNA表達(dá)恢復(fù)。5只小鼠的5個(gè)創(chuàng)面納入分析�；虻南鄬�(duì)表達(dá)水平以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
c. IF分析證實(shí)Lv-PELI2轉(zhuǎn)染后ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣表皮PELI2表達(dá)恢復(fù)。虛線(xiàn)表示表皮邊界。Epi表皮。比例尺:25 μm。
d-e. Lv-NC轉(zhuǎn)染的WT小鼠以及Lv-PELI2或Lv-NC轉(zhuǎn)染的ALKBH5-/-小鼠在PWD0、PWD2、PWD4、PWD6、PWD8的皮膚創(chuàng)面代表性圖像。比例尺:2mm。黑色虛線(xiàn)圓圈繪制了5 mm寬的原始創(chuàng)面。采用ImageJ軟件對(duì)創(chuàng)面閉合率(e)進(jìn)行量化，e表示為創(chuàng)面未愈合面積的百分比。5只小鼠的10個(gè)創(chuàng)面納入分析。創(chuàng)面閉合的相對(duì)百分比以平均值±SD表示。單因素方差分析(第2天，第4天，第6天)，***P < 0.001。Mann-Whitney檢驗(yàn)(第8天)，雙側(cè)*P< 0.05 (KO + Lv-PELI2 vs. KO + Lv-NC)。
f-g. 用Lv-NC轉(zhuǎn)染的WT小鼠和用Lv-PELI2或Lv-NC轉(zhuǎn)染的ALKBH5-/-小鼠在劃痕實(shí)驗(yàn)后第8天的創(chuàng)面再上皮化組織學(xué)分析(f)。箭頭線(xiàn)表示原創(chuàng)面間隙寬度為5mm。鈍端線(xiàn)描繪了上皮間隙，表示非上皮化創(chuàng)面寬度。再上皮化百分比定量(g)。5只小鼠的10個(gè)創(chuàng)面納入分析。再上皮化創(chuàng)面的相對(duì)百分比以均數(shù)±SD表示。Mann-Whitney檢驗(yàn)，雙側(cè)**P<0.01,****P<0.0001。虛線(xiàn)表示表皮邊界。比例尺:200 μm
（7）ALKBH5以YTHDF2依賴(lài)性方式穩(wěn)定PELI2 mRNA表達(dá)
圖8：YTHDF2與m6A修飾結(jié)合并穩(wěn)定PELI2 mRNA。
a. RIP-qPCR分析顯示YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3在PELI2轉(zhuǎn)錄本中富集。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)重復(fù)，mRNA的相對(duì)表達(dá)量與input值進(jìn)行比較，用平均值±SD表示。單因素方差分析，****P<0.0001。b. 用于RNA下拉分析的RNA探針示意圖。
c. 使用帶有或不帶有m6A修飾的PELI2 RNA探針，從細(xì)胞提取物中RNA下拉內(nèi)源性YTHDF2蛋白。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
d-e. 通過(guò)qRT-PCR (d)和WB (e)評(píng)估ALKBH5和YTHDF2敲低組或?qū)φ战MHaCaT細(xì)胞中的PELI2表達(dá)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。對(duì)PELI2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，并以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
f. 用放線(xiàn)菌素D (5 μg/mL)處理ALKBH5和YTHDF2敲除或?qū)φ誋aCaT細(xì)胞0h、2 h、4 h、6 h、8 h， qRT-PCR分析PELI2的mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
g. m6A eraser蛋白ALKBH5上調(diào)介導(dǎo)m6A甲基化降低如何通過(guò)YTHDF2依賴(lài)性方式增強(qiáng)PELI2 mRNA的穩(wěn)定性來(lái)促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化示意圖
研究結(jié)論
本研究通過(guò)MeRIP-seq和對(duì)應(yīng)的RNA-seq等分析揭示了創(chuàng)面再上皮化的一種新機(jī)制，通過(guò)該機(jī)制，m6A eraser蛋白ALKBH5在創(chuàng)緣被特異性激活，并通過(guò)從PELI2 mRNA中去除m6A位點(diǎn)并保護(hù)其免受YTHDF2介導(dǎo)的降解來(lái)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移。本研究從RNA表觀(guān)轉(zhuǎn)錄組調(diào)控角度拓展了對(duì)創(chuàng)面再上皮化的理解。重要的是，ALKBH5和PELI2可能是開(kāi)發(fā)針對(duì)難愈性創(chuàng)面患者的重編程m6A靶向治療的潛在治療靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
Huang X, Zhao Y, Liu D, Gu S, Liu Y, Khoong Y, Luo S, Zhang Z, Xia W, Wang M, Liang H, Li M, Li Q, Zan T. ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability. Inflamm Regen. 2023 Jul 14;43(1):36.
標(biāo)簽：
m6A
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