哮喘（asthma）是兒童期最常見的慢性炎癥性疾病，患病率2.6%~30.5%，兒童哮喘是世界范圍內(nèi)的一個主要健康問題。兒童哮喘是遺傳和環(huán)境因素復雜互作結(jié)果，可導致表觀遺傳和免疫失調(diào)、氣道炎癥和肺功能受損。先前研究利用850K芯片對哮喘的DNA甲基化變化的靶點特異性分析或DNA甲基化微陣列進行了描述，覆蓋人類基因組約28M CpG中的27K-850K個CpG位點。由于850K芯片對基因組覆蓋范圍有限，目前對兒童哮喘增強子區(qū)域（enhancer region）失調(diào)知之甚少，因此表觀遺傳學調(diào)控在哮喘發(fā)展中的影響仍然廣泛未知。
 
2023年1月27日，德國肺病研究中心（DZL）Irina Lehmann教授團隊在《Allergy》雜志發(fā)表題為“Global hypomethylation in childhood asthma identified by genome-wide DNA-methylation sequencing preferentially affects enhancer regions”的研究論文，該研究利用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）對三個獨立前瞻性出生隊列的40名哮喘兒童與42名性別和年齡匹配對照的的全血樣本進行DNA甲基化比較分析，鑒定出增強子區(qū)域DNA甲基化顯著失調(diào)是兒童哮喘的重要標記。
標題：Global hypomethylation in childhood asthma identified by genome-wide DNA-methylation sequencing preferentially affects enhancer regions（全基因組DNA甲基化測序鑒定兒童哮喘的整體低甲基化優(yōu)先靶向增強子區(qū)域）
發(fā)表期刊：Allergy      
發(fā)表日期：2023年01月27日    
影響因子：IF 12.4
技術(shù)：全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）等
樣品及方法：

• 三個獨立前瞻性出生隊列的40名哮喘兒童與42名性別和年齡匹配對照的的全血樣本進行全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）分析。
• 已鑒定的差異甲基化區(qū)域（DMRs）分為基因型相關(guān)、細胞類型依賴或產(chǎn)前預激。
• DMR相關(guān)基因的網(wǎng)絡分析和隨后的自然語言處理（natural language processing，NLP）在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上表觀遺傳調(diào)控功能翻譯的靶向分析得到補充。

 
摘要
本研究應用無偏好性的全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）來表征哮喘兒童與健康對照組相比的整體DNA甲基化譜。WGBS分析結(jié)果表明與對照組相比，哮喘兒童全血樣本中共鑒定出158個DMR，其中37%與嗜酸性粒細胞含量相關(guān)。研究還鑒定出主要影響增強子區(qū)域并調(diào)控關(guān)鍵免疫基因（如IL4、IL5RA和EPX）的整體低甲基化。這些DMR在n=267個樣本中得到驗證可能與異�；�因表達有關(guān)。在已建立表型中鑒定的158個DMR中有56個在出生時就已經(jīng)受到影響，至少部分與產(chǎn)前影響有關(guān)（如產(chǎn)前煙草煙霧暴露或鄰苯二甲酸鹽暴露）。
圖形摘要
全血的全基因組重亞硫酸鹽測序鑒定出158個與兒童哮喘相關(guān)的DMR，主要靶向增強子區(qū)域，包括IL-4的增強子。哮喘表型中的整體DNA低甲基化調(diào)控關(guān)鍵免疫基因，如IL5RA或EPX。哮喘中35%的異常DNA甲基化存在于臍帶血中，一定程度上與吸煙等不良產(chǎn)前影響有關(guān)。
 
縮寫：
DMR：differentially methylated region, 差異甲基化區(qū)域
WGBS：whole-genome bisulfite sequencing，全基因組重亞硫酸鹽測序
EPX：eosinophil peroxidase，嗜酸性粒細胞過氧化酶
IL5RA：interleukin 5 receptor subunit alpha，白細胞介素5受體亞基α
LINA：Lifestyle and environmental factors and their influence on newborns allergy risk，生活方式和環(huán)境因素及其對新生兒過敏風險的影響
LISA：Lifestyle-related factors on the immune system and the development of allergies in childhood;，生活方式相關(guān)因素對免疫系統(tǒng)和兒童過敏發(fā)展的影響
PASTURE：Protection against allergy: study in rural environments，抗過敏：農(nóng)村環(huán)境研究
 

研究結(jié)果：
（1）兒童哮喘的全基因組DNA低甲基化
圖1：研究設計。對三個隊列的哮喘兒童患者和對照組兒童的血樣進行WGBS，以鑒定哮喘相關(guān)的DMR。通過兩種獨立的DMR calling算法DSS和metilene來分析比較哮喘兒童和對照兒童的DMR。隨后對哮喘相關(guān)DMR進行了分析。¹基于LINA和PASTURE的臍帶血樣本。²基于LINA和LISA的可用全血樣本。³基于LINA的可用血漿樣品。
表1：全基因組亞硫酸氫鹽測序 （WGBS） 的 LINA、LISA 和 PASTURE 亞隊列特征
LQ=下四分位數(shù)，UQ=上四分位數(shù)。
^a Fisher精確測試。
^b對照組僅從非特應性兒童中選擇。
^c Mann–Whitney U型測試。

圖2：DMR分布和下游分析。
（A） Circos圖表示哮喘兒童與對照組中鑒定的158個差異甲基化區(qū)域（DMR）在所有常染色體中的分布。外圈顯示22個常染色體。內(nèi)圈條形圖代表DMR及其染色體位置。高甲基化DMR用紅色條表示，低甲基化DMRs用藍色條表示。每個條的高度表示哮喘患者和對照組之間的DNA甲基化差異。
（B） 基于基因組位點的所有哮喘DMR的KEGG通路富集。
（C） 分別通過測序或MassARRAY檢測哮喘兒童與WGBS樣本（哮喘n=40，對照n=42）、LINA研究（哮喘n=19，對照n=108）和LISA研究（哮喘病n=25，對照n=115）中與EPX和IL5RA相關(guān)DMR的DNA甲基化差異（p值來自Mann–Whitney U-test，rpb：點雙序列相關(guān)系數(shù)）。
（D） 結(jié)合LINA和LISA研究的meta分析中，EPX和IL5RA DNA甲基化（黑須）和轉(zhuǎn)錄（洋紅色須）與哮喘結(jié)局相關(guān)性。(DNA甲基化：哮喘n=44，對照組n=223, EPX轉(zhuǎn)錄：哮喘n=44，對照組n = 220, IL5RA轉(zhuǎn)錄：哮喘n=44，對照組n=222)。考慮到兒童性別、隊列、產(chǎn)前煙草煙霧暴露、特應性體質(zhì)家族史、父母受教育程度和出生時母親年齡等因素，采用ln-轉(zhuǎn)化DNA甲基化值進行l(wèi)ogistic回歸校正后的OR值為+/-95%CI。

（2）遺傳和細胞類型組成對哮喘相關(guān)DMR的影響
由于DNA甲基化水平可能強烈依賴于基因型或細胞類型組成，因此根據(jù)細胞類型依賴性和基因型相關(guān)性（gDMR）對哮喘相關(guān)DMR進行分類。根據(jù)這一分類，158個DMR中有38個（24.1%）與遺傳背景有關(guān)，而其余120個DMR（75.9%）為非基因型相關(guān)DMR（ngDMR）。共鑒定出465個與38個gDMR相關(guān)的meQTL，其中沒有一個在此前的全基因組關(guān)聯(lián)研究中被描述為哮喘風險因子。包括GWAS目錄中的所有表型性狀，共有14個DMR至少與一個性狀相關(guān)。對于其中8個DMR，該性狀顯示出與哮喘的松散表型關(guān)聯(lián)，包括肺功能（rs645601和rs7700998）。五個SNPs與不同血細胞類型計數(shù)相關(guān)，其中RPN1-DMR上游的rs4328821和rs7646596與嗜酸性粒細胞計數(shù)相關(guān)。此外，與MAD1L1-DMR相關(guān)的rs12699415與特發(fā)性肺纖維化相關(guān)。
此外，研究表明哮喘兒童血液中嗜酸性粒細胞頻率增加（Mann-Whitney U檢驗：Z=3.42，rpb=0.32，p=0.017），但其余細胞類型（B細胞、T細胞、單核細胞、NK細胞或中性粒細胞）沒有增加。采用校正后的多元回歸分析來檢驗不同的細胞類型頻率是否對所確定的DMR的DNA甲基化水平有影響，結(jié)果顯示37%的哮喘DMR（58個DMR）與嗜酸性粒細胞比例有關(guān)，只有三個DMR與B細胞、T細胞、單核細胞、NK細胞或中性粒細胞相關(guān)。然而，即使在校正后的多元回歸模型中考慮了這些細胞類型后，哮喘仍然是所有細胞類型依賴性DMR DNA甲基化狀態(tài)的重要影響因子。
 
（3）DNA甲基化變化模式與免疫調(diào)節(jié)異常相關(guān)

表2：目標分析中考慮的LINA和LISA隊列的特征
 

（4）哮喘中DNA甲基化變化影響調(diào)控中樞
圖3：哮喘相關(guān)DMR的基因組定位和IL4增強子低甲基化的功能翻譯。
（A） 餅圖表示受哮喘相關(guān)DMR影響的基因組區(qū)域比例分布。
（B） 在UCSC基因組瀏覽器中，IL4 DMR和MassARRAY分析的基因組位點和基因組區(qū)域。
（C） 散點圖顯示在LINA研究的6歲兒童中，IL4 DNA甲基化與IL4轉(zhuǎn)錄（n=112）和IL-4蛋白濃度（n=115）的關(guān)聯(lián)，以及IL-4蛋白濃度與IL4逆轉(zhuǎn)錄（n=111）的關(guān)聯(lián)。相關(guān)系數(shù)（ρ）和p值來自Spearman。（D） 6歲LINA兒童IL4增強子DNA甲基化、IL4轉(zhuǎn)錄和IL-4蛋白濃度關(guān)系的中介分析（n=111）。模型根據(jù)兒童性別、產(chǎn)前煙草煙霧暴露、特應性體質(zhì)家族史、父母受教育程度和出生時的母親年齡進行校正。在PHA刺激后檢測IL-4蛋白濃度。蛋白質(zhì)和DNA甲基化數(shù)據(jù)在分析前進行l(wèi)n轉(zhuǎn)換。間接路徑效應大小以標準化β值表示（+/-95% CI）。通過偏差校正自舉確定顯著性。MA＝MassARRAY，DMR＝差異甲基化區(qū)域。


（5）受DNA甲基化變化調(diào)控基因在功能上相互關(guān)聯(lián)
圖4：哮喘DMR相關(guān)基因的網(wǎng)絡模塊分析。所有哮喘DMR相關(guān)基因顯示出預測或基于實驗的互作關(guān)系。僅顯示具有多個連接的模塊。受DMR調(diào)控的增強子靶基因由藍色輪廓圓圈突出顯示。由自然語言處理工具確定的哮喘相關(guān)基因或類似基因用紅色字體表示。模塊命名基于通路富集分析。
 

（6）哮喘的產(chǎn)前預激（Prenatal priming for asthma）
圖5：臍帶血哮喘DMR。
（A） 對匹配的臍帶血樣本進行WGBS測序，以確定對照組兒童與后來發(fā)展為哮喘的兒童相比，出生時哮喘相關(guān)DMR的DNA甲基化水平。
（B） 餅圖表示部分基因型和非基因型相關(guān)DMR（g/ngDMR）以及那些已經(jīng)在臍帶血樣本中差異甲基化的DMR（=臍帶血DMR）。該表列出了之前與56個臍血哮喘相關(guān)DMR中包含的CPG相關(guān)的所有產(chǎn)前影響因素。紅色字體突出顯示通過自然語言處理鑒定的哮喘基因，以淺藍色顯示ngDMR，深藍色表示gDMR。
增強子靶基因來源于GeneHancer，在沒有GeneHancher注釋的情況下，給出最接近的TSS基因。（C） 臍帶血DMR相關(guān)基因的網(wǎng)絡模塊分析（左圖）和僅存在于哮喘表型中的DMR相關(guān)基因網(wǎng)絡模型分析（右圖）。僅顯示具有多個連接的模塊。模塊命名基于圖4的網(wǎng)絡。PFOS：perfluorooctane sulfonic acid，全氟辛烷磺酸，NLP：natural language processing，自然語言處理。


參考文獻：
Thürmann L, Klös M, Mackowiak SD, Bieg M, Bauer T, Ishaque N, Messingschlager M, Herrmann C, Röder S, Bauer M, Schäuble S, Faessler E, Hahn U, Weichenhan D, Mücke O, Plass C, Borte M, von Mutius E, Stangl GI, Lauener R, Karvonen AM, Divaret-Chauveau A, Riedler J, Heinrich J, Standl M, von Berg A, Schaaf B, Herberth G, Kabesch M, Eils R, Trump S, Lehmann I. Global hypomethylation in childhood asthma identified by genome-wide DNA-methylation sequencing preferentially affects enhancer regions. Allergy. 2023 Jun;78(6):1489-1506.