轉錄起始位點調控mRNA亞型的原理及實驗步驟
Cell頂級期刊：BluePippin+LRS（Long-read sequencing）揭示轉錄起始位點調控mRNA亞型的機制
近日，來自德國馬普研究所的Valerie Hilgers團隊在頂級期刊《Cell》上上發(fā)表了題為Sites of transcription initiation drive mRNA isoform selection的文章，揭示了在mRNA可變剪接過程中，轉錄起始位點（TSSs）通過表觀遺傳方法調控多聚腺苷酸位點（PASs）的詳細分子機制。
- 背景知識：
在mRNA合成過程中，任何一步出現變異都會影響成熟轉錄本的編碼區(qū)和非編碼區(qū)�？勺兗艚樱ˋS）和選擇性多聚腺苷酸化（APA）可以產生不同編碼區(qū)（CDS）或者不同長度3'端非編碼區(qū)（3'UTR）的mRNA�？勺�3'UTR區(qū)通過調控相關microRNA轉錄本和RNA結合蛋白（RBPs）互作的序列和結構元件，繼而調控編碼蛋白的豐度、定位以及蛋白復合體的組裝。而APA則依據環(huán)境不同、基因不同以及細胞類型不同來調節(jié)蛋白功能。APA參與多種細胞過程，廣泛影響細胞功能。研究發(fā)現，腫瘤和神經紊亂在內的許多人類疾病都與APA失調有關。
APA的組織或環(huán)境特異性調控，是通過轉錄因子或RBPs等效應物的活性所介導的。在不同細胞環(huán)境下，轉錄延伸因子和轉錄終止因子與可變剪切和多聚腺苷酸化（CPA, the cleavage and polyadenylation）機制的相互作用，可以增強或抑制mRNA 3'端的加工。然而，APA的基因特異性調控機制尚不清晰，雖然已有多項研究表明啟動子的轉錄調控可能與APA相關聯，但是轉錄起始位點（TSS）是否會影響poly(A) 位點（PASs）的選擇仍然未知。研究人員期待更多方法幫助挖掘轉錄起始、可變剪接、APA、3'UTR區(qū)之間的調控關系。
上述關于轉錄起始、剪接和終止位點選擇的調控機制研究，面臨的主要挑戰(zhàn)是如何將單個轉錄本的不同區(qū)域相互關聯。特別是同一mRNA中相距幾千堿基的5'端和3'端。到目前，該領域仍沒有能夠確定單個轉錄本的完整起始和終止位點、并完成測序的方法。這阻礙了對轉錄起始和終止之間調控關系的系統分析。而傳統LRS測序文庫片段通常分布在1-2 kb，其獲得的mRNA亞型長短不一且不具代表性，還會存在5'或3'端的堿基偏差。由于無法獲取完整的全長 mRNA 亞型，也就無法量化同一基因的不同 TSS 對3'端序列的影響。
APA的組織或環(huán)境特異性調控，是通過轉錄因子或RBPs等效應物的活性所介導的。在不同細胞環(huán)境下，轉錄延伸因子和轉錄終止因子與可變剪切和多聚腺苷酸化（CPA, the cleavage and polyadenylation）機制的相互作用，可以增強或抑制mRNA 3'端的加工。然而，APA的基因特異性調控機制尚不清晰，雖然已有多項研究表明啟動子的轉錄調控可能與APA相關聯，但是轉錄起始位點（TSS）是否會影響poly(A) 位點（PASs）的選擇仍然未知。研究人員期待更多方法幫助挖掘轉錄起始、可變剪接、APA、3'UTR區(qū)之間的調控關系。
上述關于轉錄起始、剪接和終止位點選擇的調控機制研究，面臨的主要挑戰(zhàn)是如何將單個轉錄本的不同區(qū)域相互關聯。特別是同一mRNA中相距幾千堿基的5'端和3'端。到目前，該領域仍沒有能夠確定單個轉錄本的完整起始和終止位點、并完成測序的方法。這阻礙了對轉錄起始和終止之間調控關系的系統分析。而傳統LRS測序文庫片段通常分布在1-2 kb，其獲得的mRNA亞型長短不一且不具代表性，還會存在5'或3'端的堿基偏差。由于無法獲取完整的全長 mRNA 亞型，也就無法量化同一基因的不同 TSS 對3'端序列的影響。
- 實驗方法：
本研究中，結合Sage Science公司BluePippin全自動DNA片段回收儀，開發(fā)了一個研究策略Combined Isoform Assembly（CIA）來準確評估和量化長或者超長mRNA異構體，顯著提升mRNA亞型發(fā)掘效率和質量（圖1）。以果蠅大腦組織（具有豐富的mRNA多樣性以及超長mRNA）為例，使用BluePippin富集＞3kb的DNA片段，顯著提升read長度（圖2），從而提升read的完整轉錄本覆蓋率（圖3、4）。
圖1 mRNA亞型組裝流程
圖2. 使用BluePippin 進行片段選擇后顯著增加了ONT cDNA的read長度（A），并優(yōu)化了神經元轉錄本的回收，其長度（B）超過了沒有進行片段選擇的LRS實驗的覆蓋范圍（灰色）
圖3. 不同組織使用不同LRS測序獲得read長度分布情況。BluePippin片段選擇后（下圖中的紅色圖表）顯著提高了全長轉錄本的覆蓋率
圖4. 在片段篩選之前（上圖）和之后（下圖），果蠅頭部的納米孔測序cDNA和PacBio Iso-seq的每個read的全長轉錄本覆蓋率，篩選后有顯著提升（對于每個read，顯示所覆蓋的目標轉錄本的分數；根據目標轉錄本的長度對讀數進行分組）
從分析結果來看，通過 BluePippin片段篩選后，獲得的轉錄本3'端堿基分布更具真實性，沒有過多的A堿基背景噪音（圖5A）。且獲得的轉錄本長度/數量遠高于先前注釋的轉錄本（圖5B）。借助BluePippin全自動片段回收儀，CIA策略生成了果蠅mRNA亞型圖譜，產生了59970個高置信度的全長轉錄本，其中包含多個新的mRNA亞型，顯著提升mRNA亞型發(fā)掘效率和質量。
圖5.（A）被丟棄3'端堿基序列與CIA方法獲取3'端堿基序列比較（B）隨著獲取轉錄本長度增加，新轉錄本數量也急劇攀升
- 實驗結果：
在不同的細胞中，通常是通過可變剪切產生不同的mRNA亞型來調節(jié)基因的表達和功能。本研究評估了轉錄起始、可變剪切和3'末端位點選擇之間的調控關系。借助長讀長測序（LRS）精確獲取超長轉錄本的兩端序列，明確果蠅組織中的mRNA亞型數量，特別是轉錄情況復雜的神經系統。研究發(fā)現，在果蠅頭部以及人類大腦器官中，轉錄起始位點(TSS)廣泛影響3'末端位點的形成。“顯性啟動子”具有特定的表觀遺傳特征如p300/CBP結合，其通過施加轉錄限制來決定剪接和多聚腺苷化類型。體內“顯性啟動子”缺失或過表達以及p300/CBP的缺失，都會改變了3'末端的序列。研究表明，TSS的選擇對轉錄本多樣性和組織特性的調控具有重要影響。
- 文獻原文閱讀：
Sage Science是全球領先的研發(fā)制造Pippin系列全自動核酸電泳片段回收儀的生產廠家，擁有美國技術專利，各個型號產品可以高效完成不同長度范圍的DNA片段的精準回收，廣泛用于二代測序、三代測序以及多種分子生物學相關領域。
環(huán)亞生物科技有限公司作為美國Sage Science公司在中國區(qū)的獨家代理商，自2011年以來將Sage Science的產品線引入國內，一直為國內用戶提供專業(yè)的全自動核酸片段回收系統的安裝測試、應用培訓，技術支持與售后維護工作，贏得客戶的一致好評與信任。環(huán)亞生物科技有限公司將一如既往的支持越來越多的Sage Science用戶。
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地址：上海市閔行區(qū)友東路358號閔欣大廈1號樓701/703/705室
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