蛋白質組定量方法之SILAC穩(wěn)定同位素標記定量方法詳解
概覽
功能特點
SILAC作為一種基于一級質譜標記定量的方法，在蛋白質組的定量中應用越來越多[1]。在這種代謝標記策略中，不同的同位素標簽標記的樣品（蛋白/多肽）在實驗過程中的早期就被混合到一起，并且同時通過LC-MS/MS進行分析。這樣從樣品處理過程中引入的系統誤差是最小的了。由于穩(wěn)定同位素標記的多肽與它們對應的天然形式的多肽有幾乎相同的理化性質，所以，不同標簽標記的同一肽段在液相梯度下是共流出的，并且它們的數量可以通過互相關聯來精確定量。
這類標記策略擴展后稱為super-SILAC [2,3]，其中標記的樣本可以單獨產生，并加入到無法進行代謝標記的實驗樣品中，例如人體組織。這樣重標蛋白質的混合樣品被用作定量的內參。
PEAKS Q支持SILAC及super-SILAC的數據分析。
PEAKS Q中的SILAC定量算法
01在相關的SILAC特征峰對之間實現ID傳輸
PEAKS Q檢測并且關聯2標或3標，在一定保留時間內具有相同電荷，相似的MS1特征峰型、在預期內的由標記所引起的質量偏移，且處在一定質量誤差范圍內的SILAC特征峰對。如果從其中一種標記狀態(tài)的feature中通過MS2譜圖得到鑒定信息，那么就可以對整個SILAC特征峰對進行定量，并用于肽和蛋白質比率的計算。例如，GLGDCLVK這條肽段的輕標在sample R_2中得到了二級碎裂和鑒定信息[4]。盡管在K8標記的對應重標中沒有得到二級譜圖，通過PEAKS Q檢測到SILAC特征峰對，就可以仍然對其進行定量，正如下圖特征峰列表選中的高亮一行。“ID Count”表示從每一個SILAC特征峰對中得到的二級質譜鑒定數目。
02在不同MS run之間通過特征峰對齊后進行ID-Transfer
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細胞培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定同位素標記方法(SILAC) 一種非常流行的基于質譜方法開發(fā)的蛋白質組定量方法。
功能特點
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精確且靈敏的SILAC成對特征峰的檢測和關聯方法
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在相關聯的SILAC特征峰對，或不同MS run之間實現ID-Transfer，減少缺失值。
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靈活的實驗設計以及統計工具幫助數據分析
SILAC作為一種基于一級質譜標記定量的方法，在蛋白質組的定量中應用越來越多[1]。在這種代謝標記策略中，不同的同位素標簽標記的樣品（蛋白/多肽）在實驗過程中的早期就被混合到一起，并且同時通過LC-MS/MS進行分析。這樣從樣品處理過程中引入的系統誤差是最小的了。由于穩(wěn)定同位素標記的多肽與它們對應的天然形式的多肽有幾乎相同的理化性質，所以，不同標簽標記的同一肽段在液相梯度下是共流出的，并且它們的數量可以通過互相關聯來精確定量。
這類標記策略擴展后稱為super-SILAC [2,3]，其中標記的樣本可以單獨產生，并加入到無法進行代謝標記的實驗樣品中，例如人體組織。這樣重標蛋白質的混合樣品被用作定量的內參。
PEAKS Q支持SILAC及super-SILAC的數據分析。
PEAKS Q中的SILAC定量算法
01在相關的SILAC特征峰對之間實現ID傳輸
PEAKS Q檢測并且關聯2標或3標，在一定保留時間內具有相同電荷，相似的MS1特征峰型、在預期內的由標記所引起的質量偏移，且處在一定質量誤差范圍內的SILAC特征峰對。如果從其中一種標記狀態(tài)的feature中通過MS2譜圖得到鑒定信息，那么就可以對整個SILAC特征峰對進行定量，并用于肽和蛋白質比率的計算。例如，GLGDCLVK這條肽段的輕標在sample R_2中得到了二級碎裂和鑒定信息[4]。盡管在K8標記的對應重標中沒有得到二級譜圖，通過PEAKS Q檢測到SILAC特征峰對，就可以仍然對其進行定量，正如下圖特征峰列表選中的高亮一行。“ID Count”表示從每一個SILAC特征峰對中得到的二級質譜鑒定數目。
02在不同MS run之間通過特征峰對齊后進行ID-Transfer
在不同MS run之間，首先對保留時間對齊，MS/MS和ID信息可以通過在較為狹窄的質量范圍和保持時間內，通過對齊特征峰的方式從另一次MS run中匹配，這就允許在這種沒有任何ID的SILAC特征峰，仍能對其進行定量。
References
- Ong, S. E., Blagoev, B., Kratchmarova, I., Kristensen, D. B., et al., Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics : MCP 2002, 1, 376-386.
- Neubert, T. A., Tempst, P., Super-SILAC for tumors and tissues. Nature methods 2010, 7, 361-362.
- Geiger, T., Cox, J., Ostasiewicz, P., Wisniewski, J. R., Mann, M., Super-SILAC mix for quantitative proteomics of human tumor tissue. Nature methods 2010, 7, 383-385.
- Liberski, A. R., Al-Noubi, M. N., Rahman, Z. H., Halabi, N. M., et al., Adaptation of a commonly used, chemically defined medium for human embryonic stem cells to stable isotope labeling with amino acids in cell culture. Journal of proteome research 2013, 12, 3233-3245.
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