期刊：Cell Reports

圖1 B細(xì)胞淋巴瘤單細(xì)胞圖譜

2. HBV⁺患者腫瘤細(xì)胞中MHC-II表達(dá)特征基因的高表達(dá)
為估計(jì)在惡性B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的任何共享表特征是否與HBV感染相關(guān)，對(duì) HBV+和 HBV- EBV-組的樣本之間的表達(dá)評(píng)分進(jìn)行了比較，只有 MHC II 表達(dá)特征的表達(dá)評(píng)分在 HBV+ 組中顯著較高（圖2A）。此外，屬于MHC II表達(dá)特征的9個(gè)基因在每一個(gè)HBV+患者的惡性細(xì)胞中顯著高于HBV-EBV-組。隨后對(duì)HBV+和HBV- EBV-惡性細(xì)胞之間的基因表達(dá)譜進(jìn)行了直接比較，MHC II表達(dá)特征的基因確實(shí)是HBV+惡性B細(xì)胞中差異表達(dá)的基因之一（圖2B）。緊接著比較了DL05和DL13兩個(gè)樣本診斷和復(fù)發(fā)的惡性細(xì)胞，在復(fù)發(fā)樣本DL13中，從惡性細(xì)胞中提取了7個(gè)基因表達(dá)特征，其中6個(gè)特征與DL05中鑒定的特征重疊（圖2C）。值得注意的是，MAPK特征只在DL13中表達(dá)。隨后對(duì)DL05和DL13的惡性B細(xì)胞進(jìn)擬時(shí)序分析，總共確定了2個(gè)分支點(diǎn)和5個(gè)狀態(tài)（圖2I），通過(guò)關(guān)注疾病復(fù)發(fā)的機(jī)制，在軌跡的分支點(diǎn) 2 處進(jìn)行分支分析，鑒定出一組在狀態(tài)5下高表達(dá)的基因，包括幾個(gè)MAPK信號(hào)相關(guān)基因，這可能與DLBCL患者的復(fù)發(fā)有關(guān)（圖2K）。
 

圖2 DLBCL的腫瘤內(nèi)和腫瘤外異質(zhì)性

3. 非惡性B細(xì)胞亞群細(xì)分
針對(duì)非惡性B細(xì)胞進(jìn)行重新聚類，細(xì)分得到5個(gè)Naive B亞群和3個(gè)Memory B細(xì)胞亞群（圖3A-3C）。隨后鑒定了每個(gè)亞簇中差異和高表達(dá)的基因，并將其聚類為7個(gè)基因集（圖3D-3E）。HBV+ 組中富集的Bmemory-1似乎與HBx刺激有關(guān)，并可能與病毒復(fù)制有（圖3G）。同樣有趣的是，在 HBV+ 樣本中發(fā)現(xiàn)了表達(dá)EGR2和表達(dá)EGR3的惡性B細(xì)胞，這表明來(lái)自HBV+患者的DLBCL樣本中的惡性細(xì)胞亞群也可能與HBx刺激相關(guān)（圖3H）。EBV+ DLBCL樣本中的B細(xì)胞 Bmemory-3 亞群可能與EBV感染有關(guān)。對(duì)浸潤(rùn)性非惡性B細(xì)胞進(jìn)行軌跡分析，確定了2個(gè)主要軌跡，并在軌跡的分支點(diǎn)1處進(jìn)一步進(jìn)行分支分析，鑒定出富含多種途徑的基因，推測(cè)它們可能決定HBV相關(guān)的細(xì)胞命運(yùn)（圖3I-3L）。
 

圖3 B細(xì)胞淋巴瘤中的非惡性B細(xì)胞

4. T細(xì)胞亞群細(xì)分
對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行重新聚類，得到CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞共16個(gè)亞群，根據(jù)之前的研究最終劃分為5個(gè)分類，分別為初始T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 （Treg）、T （Tfh） 、 T 17 （Th17）（圖4A-4C）。對(duì)于細(xì)胞毒性 CD8+ T細(xì)胞，細(xì)胞毒性標(biāo)記物的表達(dá)水平與共抑制受體的表達(dá)水平高度相關(guān)，表明這些 T 細(xì)胞中可能存在激活依賴性耗竭表達(dá)程序（圖4D）。通過(guò)比較平均細(xì)胞毒性和耗竭分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)細(xì)胞毒性亞簇 CD8cyto-4 和 CD8cyto-6 比其他細(xì)胞毒性亞簇具有更強(qiáng)的耗竭狀態(tài)（圖4E）。所有T細(xì)胞亞簇均由來(lái)自三個(gè)或更多樣本的細(xì)胞組成（圖4F）。隨后鑒定了每個(gè)亞群的差異和高表達(dá)基因，并將其聚類為 14 個(gè)基因集（圖4G）。在 HBV+ 和HBV-EBV- 組之間未觀察到每個(gè)樣本的T細(xì)胞亞群百分比存在顯著差異（圖4H）。對(duì)CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞分別進(jìn)行軌跡分析，都確定了2條主要軌跡，其中CD8+T細(xì)胞兩條主要軌跡細(xì)胞毒性和耗竭分?jǐn)?shù)都很高（圖4I-4J）。
 

圖4 B細(xì)胞淋巴瘤中的T細(xì)胞

5. 骨髓細(xì)胞亞群細(xì)分
針對(duì)髓細(xì)胞進(jìn)行重新聚類，得到3個(gè)巨噬細(xì)胞亞群（MP）、2個(gè)傳統(tǒng)DC亞群（cDC）、一個(gè)漿細(xì)胞樣DC（pDC）亞群共6個(gè)脊髓細(xì)胞亞群（圖5A-5C）。其中cDC-c1亞群高表達(dá)CLEC9A，pDC亞群高表達(dá)CLEC4C，cDC-c2亞群高表達(dá)LAMP3的同時(shí)還高表達(dá)CD274，表明 DC 亞群對(duì)T細(xì)胞具有潛在的抑制作用（圖5E-5J）。HBV+和HBV-EBV-組之間DC亞群的比例沒(méi)有觀察到顯著差異，有趣的是，cDC-c2亞群主要與DLBCL的ABC亞型相關(guān)（圖5C）。結(jié)合巨噬細(xì)胞的體外功能表型M1和M2分析，結(jié)果顯示MP-c1與促炎M1特征密切相關(guān)，MP-c2與抗炎M2特征和吞噬作用特征相關(guān)，MP-c3與M2和血管生成特征的高表達(dá)相關(guān)（圖5F）。另外，對(duì)HBV+患者的DLBCL樣本中觀察到MP-c2 的百分比顯著較高（圖5G），還對(duì) MP-c2 中的巨噬細(xì)胞與其他亞群中的巨噬細(xì)胞之間的基因表達(dá)進(jìn)行了比較，確定了MP-c2 中優(yōu)先表達(dá)的 11 個(gè)基因（圖5H）。
 

圖5 B細(xì)胞淋巴瘤中的髓系細(xì)胞

6. 腫瘤微環(huán)境中亞群間的調(diào)控關(guān)系
為了解細(xì)胞亞群之間的調(diào)控關(guān)系，研究免疫相關(guān)的配體-受體對(duì)相互作用，結(jié)果顯示骨髓細(xì)胞亞群擁有最多數(shù)量的配體，而細(xì)胞毒性 CD8+ T 細(xì)胞亞群擁有最多數(shù)量的受體（圖6A，最能預(yù)測(cè)抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞之間的調(diào)節(jié)軸（圖6B）。重點(diǎn)關(guān)注與惡性細(xì)胞的相互作用，例如，CD40LG-CD40可能促進(jìn)HBV+ 組DLBCL中惡性細(xì)胞與初始CD4+T細(xì)胞之間更強(qiáng)的相互作用（圖6C-6E）。此外，CD4+ Tfh和惡性細(xì)胞之間通過(guò)BAFF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)存在暗示性相互作用，并且這些相互作用僅在 HBV+ 患者中觀察到（圖6D）。DLBCL的另一個(gè)值得注意的發(fā)現(xiàn)是預(yù)測(cè)惡性細(xì)胞和 CD8+毒性細(xì)胞以及Tregs之間的CD70-CD27 相互作用，這可能進(jìn)一步導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭和抑制（圖6F-圖G）。
 

圖6 基于配體-受體互作的細(xì)胞通訊

參考文獻(xiàn)：
Ye X, Wang L, Nie M, Wang Y, Dong S, Ren W, Li G, Li ZM, Wu K, Pan-Hammarström Q. A single-cell atlas of diffuse large B cell lymphoma. Cell Rep. 2022 Apr 19;39（3）:110713. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110713. PMID: 35443163.