論文發(fā)表 | 黃路生院士團(tuán)隊的研究成果“BMPR-IB基因的缺失導(dǎo)致豬嚴(yán)重肢體畸形”

近日，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室黃路生院士團(tuán)隊的研究成果“BMPR-IB gene disruption causes severe limb deformities in pigs（BMPR-IB基因的缺失導(dǎo)致豬嚴(yán)重肢體畸形）”在ZOOLOGICAL RESEARCH（中科院1區(qū)top期刊，IF：4.560）上發(fā)表。平生公司的離活一體Micro CT（型號：NEMO）在論文中提供了重要的豬四肢骨骼圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為幸宇云教授，第一作者為楊強(qiáng)博士和喬傳民博士。

本文摘要

在之前的研究中，研究者們原本計劃通過CRISPR/Cas9編輯技術(shù)在豬的BMPR-IB基因中產(chǎn)生g.A746G的突變，然而卻意外地獲得了BMPR-IB純合敲除仔豬（BMPR-IB^-/-）和攜帶A746G突變的雜合子敲除仔豬（BMPR-IB^-/746G）。PCR檢測及測序結(jié)果顯示BMPR-IB基因區(qū)域中發(fā)生了復(fù)雜的基因組重排。所有BMPR-IB^-/-和BMPR-IB^-/746G仔豬都無法正常站立和行走。解剖學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，這些仔豬均呈現(xiàn)出嚴(yán)重的四肢骨骼發(fā)育異常，其中前肢的前臂骨（尺骨、橈骨）扭曲及截短，腕骨、掌骨和指骨排列紊亂；相比前肢，后肢表現(xiàn)出更嚴(yán)重的畸形，包括腓側(cè)半肢畸形、跗骨增大和腳趾關(guān)節(jié)骨排列紊亂。與BMPR-IB^-/746G個體相比，BMPR-IB^-/-仔豬的四肢骨骼畸形更為嚴(yán)重。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在雜合子敲除仔豬（BMPR-IB^-/746G）和對照組仔豬（WT）的后肢腓骨中鑒別到139個差異表達(dá)蛋白（DEPs），大多數(shù)DEPs是已知的參與骨骼或胚胎發(fā)育、TGF-β通路或腫瘤進(jìn)展的重要因子；基因本體（GO）和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域富集分析也顯示出這些通路上的變化。在排列前50的DEPs中，有一大部分蛋白如C1QA、MYO1H、SRSF1、P3H1、GJA1、TCOF1、RBM10、SPP2、MMP13及PHAX，均已被證明與骨骼發(fā)育顯著相關(guān)。該研究為解析BMPR-IB在哺乳動物肢體發(fā)育中的作用提供了新的認(rèn)識。

實驗過程

實驗動物

使用200 U/mL IV型膠原酶從1月齡大白豬胎兒中分離PFFs。代孕母豬按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行單欄飼養(yǎng)。所有動物手術(shù)均在麻醉下進(jìn)行的，以最大限度地減少痛苦。本研究選用16頭3 ~ 5日齡克隆仔豬開展相關(guān)試驗，其中肢體畸形9頭，正常7頭。

實驗方法

1頭BMPR-IB^-/-、2頭BMPR-IB^-/746G和2頭野生型(WT)克隆仔豬用于骨骼表型分析。作者使用荷蘭飛利浦公司生產(chǎn)的雙板直接數(shù)字化成像系統(tǒng)(Digital Diagnost System,簡稱DR)拍攝克隆仔豬全身骨骼的x光照片。作者進(jìn)一步分析了BMPR-IB缺失和WT克隆仔豬四肢骨骼的解剖結(jié)構(gòu)。簡單地說，用手術(shù)刀、剪刀和鑷子來剝離和去除四肢的皮膚、肌肉和相關(guān)的粘連組織。收集BMPR-IB^-/- (n=1)、BMPR-IB^-/746G (n=2)和WT (n=2) 克隆仔豬的四肢骨骼，置于−80℃保存。采用Micro-CT系統(tǒng)（平生醫(yī)療科技有限公司，中國）對每頭仔豬前肢和后肢進(jìn)行分析，掃描所用分辨率為50 μm，電壓為90 kV，電流為60 μA。通過測量距前肢橈骨和后肢脛骨生長板遠(yuǎn)端2mm的2mm截面來評估骨小梁的定量。對于皮質(zhì)骨，分析前肢橈骨和后肢脛骨中軸以上3mm的部分。基于閾值分割和三維測量，使用Avatar v1.6.5軟件(平生醫(yī)療科技有限公司，中國)定量分析橈骨和脛骨的骨小梁和皮質(zhì)骨(BV/TV，分段骨體積與總體積的比值;BS/TV，分割骨表面與總?cè)莘e的比值; Tb.Sp，骨小梁間的平均距離，采用直接3D方法評估;Tb.N，單位長度骨小梁的平均數(shù)量，是骨小梁結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵參數(shù)；Tb.BMD，骨密度測量，反映以鈣含量為代表的骨骼強(qiáng)度;Ct.BMD:皮質(zhì)骨礦物質(zhì)密度;Ct.Th為平均皮質(zhì)厚度;Ct.ar/Tt.ar，皮質(zhì)面積分?jǐn)?shù))。

實驗結(jié)果

克隆仔豬前肢骨骼Micro-CT分析 A: WT、BMPR-IB^-/746G和BMPR-IB^-/-仔豬前肢骨骼的高分辨率Micro-CT掃描。B: 3種基因型仔豬橈骨的3D和2D灰度圖像。C:橈骨遠(yuǎn)端骨小梁和皮質(zhì)骨定量結(jié)果。數(shù)據(jù)為平均值±SD (WT, n=4;BMPRIB^-/746G, n=4;BMPR-IB^-/-，n = 2)。ns: P>0.05;*: P<0.05;* *: P<0.01。白色標(biāo)尺，1厘米。BV/TV:骨小梁體積分?jǐn)?shù);BS/TV，骨小梁表面密度;Tb.Sp,骨小梁間距; Tb.N,骨小梁數(shù)目;Tb.BMD，骨小梁礦物質(zhì)密度;Ct.BMD:皮質(zhì)骨礦物質(zhì)密度;Ct.Th,皮質(zhì)厚度;Ct.ar/Tt.Ar:皮質(zhì)面積分?jǐn)?shù)。

克隆仔豬后肢骨骼Micro-CT分析 A: WT、BMPR-IB^-/746G和BMPR-IB^-/-仔豬后肢骨骼的高分辨率Micro-CT掃描。B: 3種基因型仔豬脛骨3D和2D灰度圖像。C:脛骨遠(yuǎn)端骨小梁、皮質(zhì)骨定量結(jié)果。數(shù)據(jù)為平均值±SD (WT, n=4;BMPR-IB^-/746G, n=4;BMPR-IB^-/-，n=2)。ns: P>0.05，*: P<0.05;* *: P<0.01。白色標(biāo)尺，1厘米。

結(jié)論

通過CRISPR-Cas9和SCNT獲得的BMPR-IB缺失仔豬表現(xiàn)出行走困難和嚴(yán)重的前肢和后肢發(fā)育畸形。BMPR-IB^-/746G和BMPR-IB^-/-仔豬表型相似。研究者們在肢體畸形的BMPR-IB^-/746G仔豬的后肢腓骨中發(fā)現(xiàn)139個DEPs，其中大部分參與骨骼和(或)胚胎發(fā)育。他們的研究為大型哺乳動物BMPR-IB缺失提供了新的見解。

實驗儀器

Micro CT（型號：NEMO）（平生醫(yī)療科技）

影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）