植物微粒體分離試劑盒使用說明
瀏覽次數(shù):1578 發(fā)布日期:2023-7-31
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描述:
從植物中分離微粒體膜是實(shí)驗(yàn)室中常見實(shí)驗(yàn),植物細(xì)胞中微粒體部分是植物研究項(xiàng)目的重點(diǎn)。微粒體中富含細(xì)胞膜,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體,液泡膜和其他膜結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的分離方法需要大量的樣品量,通過超速離心來(lái)分離不同的膜結(jié)構(gòu),步驟復(fù)雜。MM-018 試劑盒提供了一種快速,簡(jiǎn)單無(wú)需特殊儀器的微粒體膜分離方法,很小的樣品量(200mg)即可提取。配合優(yōu)化的緩沖液系統(tǒng)和通過簡(jiǎn)單的離心即可分離水溶性胞漿蛋白和非水溶性微粒體,特別是細(xì)胞膜部分。無(wú)需超高速離心,操作時(shí)間小于 1 小時(shí)即可從植物中提取天然的微粒體蛋白,蛋白質(zhì)得率可達(dá) 100-200ug/樣品。
應(yīng)用:
可應(yīng)用于 SDS-PAGE,WB,ELISA,IP,酶活性測(cè)定,蛋白質(zhì)組學(xué)與膜轉(zhuǎn)運(yùn)分析。
試劑盒組份(50T):
1. 25 ml 緩沖液 A
2. 15 ml 緩沖液 B
3. 50 個(gè)離心管柱及 2.0ml 接收管
4.2 根塑料研磨棒
儲(chǔ)存:
-20℃儲(chǔ)存。
所需附加材料
1XPBS(pH7.2-7.4)
臺(tái)式離心機(jī)(最高離心力 14,000-16,000Xg)
重要產(chǎn)品信息
提取分離前,建議添加蛋白酶抑制劑到 buffer A 中。研究蛋白磷酸化,磷酸酶抑制劑應(yīng)在使用前加入緩沖液 A中。(添加請(qǐng)按照蛋白酶或磷酸酶抑制劑母液比例,例如母液是 100x,添加時(shí)按照 1:100 添加,1ml 緩沖液 A添加 10ul 抑制劑)推薦使用 BCA 試劑盒用于蛋白濃度測(cè)定。
分離步驟:
1. 將緩沖液,離心管柱及接收管套管放置冰上預(yù)冷。
2. 取 200mg 新鮮植物組織放入離心管柱套管中。植物葉片樣品,先剪碎,卷起或者折疊減小體積放入離心管柱套管中。用 200ul 或 1ml 吸頭反復(fù)擠壓葉片 60 次減少體積。種子和軟莖樣品,用鋒利的刀片切割成小片,放置在離心管柱套管中。
3. 加入 300ul 預(yù)冷的 buffer A 到離心管柱中(注意:震蕩搖勻 buffer A 后迅速吸。。用試劑盒中提供的塑料研磨棒反復(fù)按壓扭轉(zhuǎn)研磨植物組織 2-3 分鐘(大概 100 次)。(注意:塑料研磨棒可以重復(fù)使用,用蒸餾水徹底沖洗干凈,用紙巾擦干即可)。
4. 蓋上蓋子,4℃,14,000Xg,離心 20 分鐘。棄去離心管柱,將接收管中上清完全棄去。
5. 在接收管中加入 300ul 預(yù)冷的 buffer B,用吸頭上下吹打或渦旋震蕩重懸沉淀。4℃,11,000Xg,離心 10 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的 2.0ml 預(yù)冷的接收管中。
6. 加入 1ml 預(yù)冷的 1 X PBS(pH7.2-7.4)到管子中,翻轉(zhuǎn)幾次混勻。4℃,14,000Xg,離心 30 分鐘,棄去上清液,沉淀即為微粒體組分。微粒體可根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)使用含不同表面活性劑的緩沖液(50-200ul)溶解。推薦使用下表中 MinuteTM 系列溶解液溶解微粒體。做等電聚焦(2D 凝膠第一維)我們建議使用:7M 尿素/2M硫脲/2%Chaps 和 20mM DTT (使用前將 DTT 加入以上混合液中)。