m6A-seq應(yīng)用揭示RBM33參與調(diào)控m6A去甲基化酶ALKBH5活性及底物選擇性
RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding protein，RBP）是一類結(jié)構(gòu)和功能多樣化的蛋白質(zhì)，參與多種生物過程。越來越多的證據(jù)表明，RBP通過調(diào)控編碼或非編碼RNA的可變剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定性、降解和翻譯，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但RBP中RNA結(jié)合motif蛋白33（RNA-binding motif protein 33, RBM33）的生物學(xué)功能在很大程度上未知。N6-甲基腺苷（m6A）甲基化是真核生物mRNA中最豐富的內(nèi)部修飾，是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過程, m6A由m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（MTC）沉積。盡管MTC可以被各種細(xì)胞組分招募到靶轉(zhuǎn)錄本，但目前還不清楚如何實(shí)現(xiàn)去甲基化選擇性，是否存在類似的接頭蛋白來促進(jìn)所選轉(zhuǎn)錄本的m6A去甲基化呢？
2023年5月30日，美國(guó)芝加哥大學(xué)何川教授團(tuán)隊(duì)和美國(guó)佛羅里達(dá)大學(xué)錢志堅(jiān)教授團(tuán)隊(duì)合作在《Molecular Cell》雜志上發(fā)表題為“RBM33 is a unique m6A RNA binding protein that regulates ALKBH5 demethylase activity and substrate selectivity”的研究論文，該研究通過MeRIP-seq、RIP-seq、RNA-seq等實(shí)驗(yàn)分析方法揭示了在頭頸鱗狀細(xì)胞癌 (head-neck squamous cell carcinoma，HNSCC) 中，RNA 結(jié)合蛋白R(shí)BM33參與調(diào)控m6A去甲基化酶ALKBH5活性及其底物選擇性，并進(jìn)一步驗(yàn)證了靶向ALKBH5/RBM33復(fù)合體m6A 去甲基化酶活性作為HNSCC 治療策略的潛在可能。
標(biāo)題：RBM33 is a unique m6A RNA binding protein that regulates ALKBH5 demethylase activity and substrate selectivity（RBM33是一種特異性m6A RNA結(jié)合蛋白，可以調(diào)控ALKBH5去甲基化酶活性和底物選擇性）
時(shí)間：2023-05-30
期刊：Molecular Cell
影響因子：IF 16
技術(shù)平臺(tái)：PAR-CLIP-seq 、m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq、qRT-PCR、WB等
研究摘要：
本研究鑒定出一種以前未被識(shí)別的m6A結(jié)合蛋白——RBM33，RBM33通過與ALKBH5結(jié)合形成復(fù)合體，在ALKBH5介導(dǎo)的mRNA m6A去甲基化轉(zhuǎn)錄本亞群中發(fā)揮關(guān)鍵作用。RBM33將ALKBH5招募到其m6A標(biāo)記的底物上，并通過去除其SUMO化來激活A(yù)LKBH5去甲基化酶活性。研究進(jìn)一步證明RBM33對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）的腫瘤發(fā)生至關(guān)重要。RBM33通過招募ALKBH5去甲基化和穩(wěn)定DDIT4 mRNA來促進(jìn)自噬，進(jìn)而促進(jìn)RBM33在HNSCC細(xì)胞中的致癌功能�？傊�，本研究揭示了在腫瘤發(fā)生過程中m6A轉(zhuǎn)錄本亞群選擇性去甲基化的分子機(jī)制，這可能解釋了其他細(xì)胞過程中去甲基化的選擇性，并表明了它在維持HNSCC腫瘤發(fā)生中的重要性。
圖形摘要
研究設(shè)計(jì)
研究結(jié)果：
（1）RBM33與ALKBH5形成復(fù)合體，調(diào)控依賴ALKBH5的mRNA m6A甲基化
• LC-MS分析發(fā)現(xiàn)ALKBH5是UM-SCC-1細(xì)胞中與RBM33相互作用的蛋白質(zhì)之一；
• 在UM-SCC-1細(xì)胞中，內(nèi)源性ALKBH5可以和內(nèi)源性RBM33發(fā)生相互作用；
• 免疫染色分析顯示，RBM33在細(xì)胞中與ALKBH5共定位。
• RBM33不與strep標(biāo)記的METTL3、METTL14和FTO相互作用；
• 與ALKBH5過表達(dá)誘導(dǎo)的m6A去甲基化類似，RBM33過表達(dá)導(dǎo)致mRNA m6 A甲基化顯著降低；
• ALKBH5過表達(dá)引起的細(xì)胞mRNA m6A下調(diào)可以被敲低RBM33所逆轉(zhuǎn)；
• 同樣敲除ALKBH5 可以阻止RBM33過表達(dá)所介導(dǎo)的m6A下調(diào)。
• 去除RBM33的RRM結(jié)構(gòu)域去除后喪失其與m6A修飾的RNA寡核苷酸結(jié)合的能力；
• RIP-Seq顯示近70%的ALKBH5靶基因與RBM33結(jié)合。
• 絕大多數(shù)RBM33和ALKBH5的共同結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本和LncRNAs中；
• PAR-CLIP揭示m6A修飾經(jīng)典序列“RACH”出現(xiàn)在RBM33結(jié)合位點(diǎn)；
• 超過50%的RBM33結(jié)合位點(diǎn)位于ALKBH5結(jié)合位點(diǎn)上游100 nt處；
• RBM33 KD導(dǎo)致1330個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾上調(diào)，其中65%的轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾同樣可以被ALKBH5 敲低所誘導(dǎo)。
（3）ALKBH5通過RBM33結(jié)合m6A修飾底物以調(diào)節(jié)HNSCC細(xì)胞中m6A修飾
• RBM33蛋白中的S1101A或 R1134A顯著破壞了ALKBH5與RBM33之間的相互作用
• ALKBH5中的K132A、E153A或T265A，顯著破壞了ALKBH5與RBM33之間的相互作用。
• RBM33的S1101A和R1134A突變體與野生型RBM33對(duì)m6A修飾底物的結(jié)合親和力相似；
• RBM33S1101A和RBM33R1134A突變體都失去了調(diào)控mRNA m6A甲基化的能力；
• ALKBH5的K132A、E153A和T265A突變體喪失與m6A修飾底物的結(jié)合能力；
• ALKBH5的K132A、E153A和T265A突變體喪失m6A去甲基化酶活性。
（4）RBM33通過募集deSUMOylase SENP1激活A(yù)LKBH5去甲基化酶活性
• RBM33 KD顯著誘導(dǎo)ALKBH5 SUMOylation；
• RBM33 KD不影響ALKBH5和PIAS4相互作用，但破壞了ALKBH5和SENP1的相互作用；
• RBM33過表達(dá)增強(qiáng)了ALKBH5與SENP1的相互作用；
• RBM33與SENP1互作，而SENP1不依賴于ALKBH5。
（5）RBM33通常在HNSCC中上調(diào)，并且是腫瘤發(fā)生所必需的
• 免疫組化顯示，RBM33在不同階段HNSCC患者原發(fā)腫瘤中的表達(dá)高表達(dá)；
• RBM33 KD特異性誘導(dǎo)HNSCC細(xì)胞凋亡并抑制其克隆形成；
• RBM33 KD抑制HNSCC細(xì)胞克隆形成；
• RBM33 KD顯著抑制異種移植小鼠體內(nèi)HNSCC的生長(zhǎng)。
（6）RBM33和ALKBH5相互依賴以維持HNSCC的致瘤性
• ALKBH5在HNSCC原發(fā)腫瘤中的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常鄰近組織；
• ALKBH5 KD可選擇性誘導(dǎo)HNSCC細(xì)胞凋亡；
• ALKBH5 KD顯著抑制HNSCC細(xì)胞的集落形成能力；
• 在UMSCC-1細(xì)胞中，ALKBH5過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖增加被RBM33 KD阻斷，反之亦然；
• ALKBH5 KD對(duì)異種移植小鼠HNSCC體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用略高于RBM33 KD；
• ALKBH5小分子抑制劑2,4- PDCA顯著抑制了小鼠中人HNSCC患者來源的異種移植物(PDX)的生長(zhǎng)
（7）DDIT4在HNSCC中是RBM33關(guān)鍵的下游靶點(diǎn)
• 基因集富集分析(GSEA)分析顯示，RBM33或ALKBH5 KD上的下調(diào)基因在缺氧、RAS和RAF通路中富集；
• GO分析表明，RBM33和ALKBH5共同調(diào)控的基因在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)剪切途徑中富集；
• RBM33或ALKBH5 KD上m6A甲基化上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本也參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工和剪接體途徑。
• DDIT4在RBM33或ALKBH5 KD上m6A甲基化修飾顯著增加；
• DDIT4的高表達(dá)與HNSCC患者的不良預(yù)后相關(guān)
• DDIT4的轉(zhuǎn)錄水平被野生型而不是△RRM的RBM33或ALKBH5突變體促進(jìn)；
• DDIT4促進(jìn)自噬，RBM33或ALKBH5 KD均能顯著抑制自噬。
• 過表達(dá)DDIT4解除RBM33或ALKBH5 KD介導(dǎo)的異種移植小鼠HNSCC生長(zhǎng)抑制。
研究結(jié)論：
RBM33是一種新的m6A結(jié)合蛋白，可與ALKBH5形成復(fù)合物。ALKBH5/RBM33 通過特異性去除DDIT4 轉(zhuǎn)錄本上的m6A修飾、促進(jìn)DDIT4 RNA 穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞自噬，進(jìn)而促進(jìn)HNSCC 的生長(zhǎng)。
參考文獻(xiàn)：
Yu F, Zhu AC, Liu S, Gao B, Wang Y, Khudaverdyan N, Yu C, Wu Q, Jiang Y, Song J, Jin L, He C, Qian Z. RBM33 is a unique m6A RNA-binding protein that regulates ALKBH5 demethylase activity and substrate selectivity. Mol Cell. 2023 Jun 15;83(12):2003-2019.e6.
標(biāo)題：RBM33 is a unique m6A RNA binding protein that regulates ALKBH5 demethylase activity and substrate selectivity（RBM33是一種特異性m6A RNA結(jié)合蛋白，可以調(diào)控ALKBH5去甲基化酶活性和底物選擇性）
期刊：Molecular Cell
影響因子：IF 16
技術(shù)平臺(tái)：PAR-CLIP-seq 、m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq、qRT-PCR、WB等
研究摘要：
本研究鑒定出一種以前未被識(shí)別的m6A結(jié)合蛋白——RBM33，RBM33通過與ALKBH5結(jié)合形成復(fù)合體，在ALKBH5介導(dǎo)的mRNA m6A去甲基化轉(zhuǎn)錄本亞群中發(fā)揮關(guān)鍵作用。RBM33將ALKBH5招募到其m6A標(biāo)記的底物上，并通過去除其SUMO化來激活A(yù)LKBH5去甲基化酶活性。研究進(jìn)一步證明RBM33對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）的腫瘤發(fā)生至關(guān)重要。RBM33通過招募ALKBH5去甲基化和穩(wěn)定DDIT4 mRNA來促進(jìn)自噬，進(jìn)而促進(jìn)RBM33在HNSCC細(xì)胞中的致癌功能�？傊�，本研究揭示了在腫瘤發(fā)生過程中m6A轉(zhuǎn)錄本亞群選擇性去甲基化的分子機(jī)制，這可能解釋了其他細(xì)胞過程中去甲基化的選擇性，并表明了它在維持HNSCC腫瘤發(fā)生中的重要性。
圖形摘要
研究設(shè)計(jì)
（1）RBM33與ALKBH5形成復(fù)合體，調(diào)控依賴ALKBH5的mRNA m6A甲基化
• LC-MS分析發(fā)現(xiàn)ALKBH5是UM-SCC-1細(xì)胞中與RBM33相互作用的蛋白質(zhì)之一；
• 在UM-SCC-1細(xì)胞中，內(nèi)源性ALKBH5可以和內(nèi)源性RBM33發(fā)生相互作用；
• 免疫染色分析顯示，RBM33在細(xì)胞中與ALKBH5共定位。
• RBM33不與strep標(biāo)記的METTL3、METTL14和FTO相互作用；
• 與ALKBH5過表達(dá)誘導(dǎo)的m6A去甲基化類似，RBM33過表達(dá)導(dǎo)致mRNA m6 A甲基化顯著降低；
• ALKBH5過表達(dá)引起的細(xì)胞mRNA m6A下調(diào)可以被敲低RBM33所逆轉(zhuǎn)；
• 同樣敲除ALKBH5 可以阻止RBM33過表達(dá)所介導(dǎo)的m6A下調(diào)。
（2）RBM33是新的m6A結(jié)合蛋白，通過RRM結(jié)合m6A RNA轉(zhuǎn)錄本，并招募ALKBH5將其去甲基化
• 內(nèi)源性RBM33與m6A修飾的RNA底物結(jié)合親和力比與未修飾的RNA寡核苷酸的結(jié)合親和力高；• 去除RBM33的RRM結(jié)構(gòu)域去除后喪失其與m6A修飾的RNA寡核苷酸結(jié)合的能力；
• RIP-Seq顯示近70%的ALKBH5靶基因與RBM33結(jié)合。
• 絕大多數(shù)RBM33和ALKBH5的共同結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本和LncRNAs中；
• PAR-CLIP揭示m6A修飾經(jīng)典序列“RACH”出現(xiàn)在RBM33結(jié)合位點(diǎn)；
• 超過50%的RBM33結(jié)合位點(diǎn)位于ALKBH5結(jié)合位點(diǎn)上游100 nt處；
• RBM33 KD導(dǎo)致1330個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾上調(diào)，其中65%的轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾同樣可以被ALKBH5 敲低所誘導(dǎo)。
• RBM33蛋白中的S1101A或 R1134A顯著破壞了ALKBH5與RBM33之間的相互作用
• ALKBH5中的K132A、E153A或T265A，顯著破壞了ALKBH5與RBM33之間的相互作用。
• RBM33的S1101A和R1134A突變體與野生型RBM33對(duì)m6A修飾底物的結(jié)合親和力相似；
• RBM33S1101A和RBM33R1134A突變體都失去了調(diào)控mRNA m6A甲基化的能力；
• ALKBH5的K132A、E153A和T265A突變體喪失與m6A修飾底物的結(jié)合能力；
• ALKBH5的K132A、E153A和T265A突變體喪失m6A去甲基化酶活性。
（4）RBM33通過募集deSUMOylase SENP1激活A(yù)LKBH5去甲基化酶活性
• RBM33 KD顯著誘導(dǎo)ALKBH5 SUMOylation；
• RBM33 KD不影響ALKBH5和PIAS4相互作用，但破壞了ALKBH5和SENP1的相互作用；
• RBM33過表達(dá)增強(qiáng)了ALKBH5與SENP1的相互作用；
• RBM33與SENP1互作，而SENP1不依賴于ALKBH5。
（5）RBM33通常在HNSCC中上調(diào)，并且是腫瘤發(fā)生所必需的
• 免疫組化顯示，RBM33在不同階段HNSCC患者原發(fā)腫瘤中的表達(dá)高表達(dá)；
• RBM33 KD特異性誘導(dǎo)HNSCC細(xì)胞凋亡并抑制其克隆形成；
• RBM33 KD抑制HNSCC細(xì)胞克隆形成；
• RBM33 KD顯著抑制異種移植小鼠體內(nèi)HNSCC的生長(zhǎng)。
（6）RBM33和ALKBH5相互依賴以維持HNSCC的致瘤性
• ALKBH5在HNSCC原發(fā)腫瘤中的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常鄰近組織；
• ALKBH5 KD可選擇性誘導(dǎo)HNSCC細(xì)胞凋亡；
• ALKBH5 KD顯著抑制HNSCC細(xì)胞的集落形成能力；
• 在UMSCC-1細(xì)胞中，ALKBH5過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖增加被RBM33 KD阻斷，反之亦然；
• ALKBH5 KD對(duì)異種移植小鼠HNSCC體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用略高于RBM33 KD；
• ALKBH5小分子抑制劑2,4- PDCA顯著抑制了小鼠中人HNSCC患者來源的異種移植物(PDX)的生長(zhǎng)
（7）DDIT4在HNSCC中是RBM33關(guān)鍵的下游靶點(diǎn)
• 基因集富集分析(GSEA)分析顯示，RBM33或ALKBH5 KD上的下調(diào)基因在缺氧、RAS和RAF通路中富集；
• GO分析表明，RBM33和ALKBH5共同調(diào)控的基因在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)剪切途徑中富集；
• RBM33或ALKBH5 KD上m6A甲基化上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本也參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工和剪接體途徑。
• DDIT4在RBM33或ALKBH5 KD上m6A甲基化修飾顯著增加；
• DDIT4的高表達(dá)與HNSCC患者的不良預(yù)后相關(guān)
• DDIT4的轉(zhuǎn)錄水平被野生型而不是△RRM的RBM33或ALKBH5突變體促進(jìn)；
• DDIT4促進(jìn)自噬，RBM33或ALKBH5 KD均能顯著抑制自噬。
• 過表達(dá)DDIT4解除RBM33或ALKBH5 KD介導(dǎo)的異種移植小鼠HNSCC生長(zhǎng)抑制。
研究結(jié)論：
RBM33是一種新的m6A結(jié)合蛋白，可與ALKBH5形成復(fù)合物。ALKBH5/RBM33 通過特異性去除DDIT4 轉(zhuǎn)錄本上的m6A修飾、促進(jìn)DDIT4 RNA 穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞自噬，進(jìn)而促進(jìn)HNSCC 的生長(zhǎng)。
參考文獻(xiàn)：
Yu F, Zhu AC, Liu S, Gao B, Wang Y, Khudaverdyan N, Yu C, Wu Q, Jiang Y, Song J, Jin L, He C, Qian Z. RBM33 is a unique m6A RNA-binding protein that regulates ALKBH5 demethylase activity and substrate selectivity. Mol Cell. 2023 Jun 15;83(12):2003-2019.e6.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
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