1. 什么是納米抗體

 

納米抗體，也稱(chēng)為基于單結(jié)構(gòu)域的 VHH，是源自駱駝科中發(fā)現(xiàn)的僅重鏈 IgG 抗體的抗體片段。納米抗體具有傳統(tǒng)單克隆抗體所缺乏的優(yōu)勢(shì)，多年來(lái)，一直受到研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，尤其是在疾病的診斷和治療方面。促使世界上第一個(gè)基于納米抗體的藥物 (Caplacizumab) 在 2018 年獲得批準(zhǔn)，隨后不久其他藥物也獲得批準(zhǔn)。

 

2. 納米抗體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

 

駱駝 HCAb 由一個(gè)結(jié)晶片段 ( Fc ) 區(qū)域組成，與常規(guī)抗體的片段同源，直接連接到由單個(gè) VHH 結(jié)構(gòu)域組成的片段抗原結(jié)合 (Fab) 區(qū)域。與 150 kDa 的常規(guī) IgG相比，缺少 CH1 結(jié)構(gòu)域和輕鏈會(huì)導(dǎo)致 90 kDa 的分子量降低。HCAb 的 VHH 片段大小約為 2.5 × 4.0 nm，分子量為 15 kDa，可以克隆和重組表達(dá)為能夠結(jié)合抗原庫(kù)的單體Nb。

 

 

圖1： 傳統(tǒng) m(IgG)Ab、HCAb 和 VHH (Nb) 的結(jié)構(gòu)示意圖及特征描述

 

3. 納米抗體的優(yōu)缺點(diǎn)

 

3.1 納米抗體的優(yōu)點(diǎn)

（1）在高溫和pH下的穩(wěn)定性；

（2）VHH可以識(shí)別通常不被常規(guī)抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn)；

（3）它們的小分子片段有助于快速組織滲透和標(biāo)記應(yīng)用，包括跨越血腦屏障；

（4）用于大規(guī)模生產(chǎn)節(jié)約成本的替代品。

3.2 納米抗體的缺點(diǎn)

納米抗體（VHH抗體）由于分子量較小，約為15kDa，相當(dāng)于傳統(tǒng)IgG抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)，因此針對(duì)VHH抗體的二抗不具有普遍適用性，需要將VHH融合Fc片段進(jìn)行共表達(dá)進(jìn)行解決二抗識(shí)別問(wèn)題（泰克生物提供多種抗羊駝二抗，可用于免疫血清效價(jià)檢測(cè)）

 

4. 泰克生物能夠?yàn)榭蛻?hù)提供高質(zhì)量的駝源納米抗體開(kāi)發(fā)服務(wù)

 

泰克生物可以提供多種駝源納米抗體開(kāi)發(fā)服務(wù)，包括羊駝、大羊駝、駱駝、美洲駝等，基于噬菌體展示技術(shù)平臺(tái)，泰克生物可以提供包括抗原設(shè)計(jì)、羊駝免疫、文庫(kù)構(gòu)建與篩選、活性功能驗(yàn)證等主要實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，并為科學(xué)家提供高特異性和高親和力的羊駝VHH抗體。

 

5. 納米抗體的制備

 

相比較傳統(tǒng)的單克隆抗體，納米抗體的制備具有很大優(yōu)勢(shì)。可以概括為免疫羊駝獲得抗體基因和噬菌體展示來(lái)獲得目的抗體序列。主要分為羊駝免疫，噬菌體文庫(kù)構(gòu)建，篩選抗體庫(kù)、抗體表達(dá)與功能驗(yàn)證四個(gè)步驟。

5.1羊駝免疫

挑選適齡羊駝→準(zhǔn)備抗原→免疫羊駝→采血測(cè)定效價(jià)→PBMC細(xì)胞分離

5.2 噬菌體文庫(kù)構(gòu)建

RNA提取→cDNA反轉(zhuǎn)錄合成→PCR擴(kuò)增→連接載體并電轉(zhuǎn)化→細(xì)菌文庫(kù)/噬菌體文庫(kù)建立

5.3抗體庫(kù)篩選

常規(guī)使用的篩選方法是固相篩選，磁珠和細(xì)胞篩選，泰克生物可以根據(jù)客戶(hù)需求提供定制化的篩選體系。

5.4抗體表達(dá)與功能驗(yàn)證

構(gòu)建哺乳表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)→過(guò)鎳柱純化→親和力測(cè)定

 

圖2：Fc-VHH納米抗體表達(dá)結(jié)果圖片

 

6. 納米抗體在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用

6.1抗癌納米抗體

Nbs 由于出色的腫瘤穿透能力、識(shí)別獨(dú)特抗原的能力以及其他優(yōu)勢(shì)使其成為癌癥治療領(lǐng)域有前途的候選者。Nb 癌癥治療的一種途徑是開(kāi)發(fā)表達(dá)對(duì)腫瘤抗原具有特異性的 Nb 嵌合抗原受體 (CAR) T 細(xì)胞。從患者體內(nèi)提取 T 細(xì)胞并進(jìn)行基因改造以表達(dá)腫瘤抗原特異性 Nb，然后再重新注入患者體內(nèi)，從而使 T 細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞毒性分子、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制結(jié)合和中和腫瘤細(xì)胞。2018 年，靶向癌癥生物標(biāo)志物 B 細(xì)胞成熟抗原治療復(fù)發(fā)性骨髓瘤的 Nb CAR T 細(xì)胞候選藥物， 1 期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示出令人滿(mǎn)意的結(jié)果。它成功完成了 1 期臨床試驗(yàn)，并進(jìn)行了進(jìn)一步的 2 期試驗(yàn)。首次給藥4年后進(jìn)行的一項(xiàng)后續(xù)研究也表明，改良 T 細(xì)胞具有良好的長(zhǎng)期安全性和耐久性�；�于 1 期和 2 期臨床試驗(yàn)的成功，這款 Nb CAR-T 候選細(xì)胞更名為 Ciltacabtagene autoleucel，于 2022 年 2 月被 FDA 批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性骨髓瘤。還開(kāi)展了許多其他概念驗(yàn)證研究，以開(kāi)發(fā)靶向其他癌癥生物標(biāo)志物（如 CD20、EGFR 和 HER2）的表達(dá) Nb 的 CAR T細(xì)胞。

6.2抗自身免疫性疾病的納米抗體

第一個(gè)獲得 EMA 和 FDA 批準(zhǔn)的 28-kDa 納米抗體是二價(jià)納米抗體 Caplacizumab ，用于治療血栓性血小板減少性紫癜 (TTP)，標(biāo)志著Nb 治療領(lǐng)域取得了里程碑式的成功。不久之后，在 2019 年，Caplacizumab 也被美國(guó) FDA 批準(zhǔn)用于消費(fèi)者處方。另一種進(jìn)入商業(yè)市場(chǎng)的是 Ozoralizumab，由 Taisho Pharmaceuticals 在 Ablynx 許可下開(kāi)發(fā)。 截至 2022 年 9 月，靶向腫瘤壞死因子-α 的 Ozoralizumab 在日本獲準(zhǔn)用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。Vobarilizumab 是另一種很有前途的 Nb 藥物，用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡，靶向白細(xì)胞介素 6 受體。這種療法目前正在進(jìn)行 2 期臨床試驗(yàn)。

其他用于治療各種自身免疫性疾病的 Nb 目前正處于臨床試驗(yàn)的各個(gè)階段。這些治療包括 (1) Sonelokimab 針對(duì)白細(xì)胞介素 17A/F 治療銀屑病，(2) Gefurulimab  針對(duì)針對(duì)乙酰膽堿受體自身抗體，治療全身性重癥肌無(wú)力，(3) Nb M6495 靶向具有血小板反應(yīng)蛋白的解聯(lián)素和金屬蛋白酶，用于治療骨關(guān)節(jié)炎 (4) Nb V565抗腫瘤壞死因子用于克羅恩氏病。

 

 

圖3：納米抗體藥物研究現(xiàn)狀

6.3 抗傳染病的納米抗體

與腫瘤學(xué)和自身免疫性疾病的廣泛 Nb 候選藥物相反，幾乎沒(méi)有針對(duì)病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)引起的傳染病的治療候選藥物。然而，有一些 Nb 治療傳染病的報(bào)道，例如針對(duì)輪狀病毒治療腹瀉的 VHH 批號(hào) 203027 和治療呼吸道合胞病毒下呼吸道感染的 ALX-0171。不幸的是，自2013 年以來(lái)沒(méi)有發(fā)布關(guān)于前者的更新，而后者未能在 2b 期試驗(yàn)中產(chǎn)生顯著結(jié)果。最近報(bào)道了一種用于治療空腸彎曲桿菌感染的治療性 Nb 候選藥物 LMN-101，目前正在進(jìn)行 2 期試驗(yàn)。缺乏治療性 Nbs 并不意味著 Nbs 不適合開(kāi)發(fā)治療病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)的療法，而是表明該領(lǐng)域仍處于起步階段。

自從三十多年前偶然發(fā)現(xiàn)納米抗體以來(lái)，Nbs 領(lǐng)域研究成果呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。Nbs 相對(duì)于傳統(tǒng) mAb 和傳統(tǒng) mAb 片段的眾多優(yōu)勢(shì)推動(dòng)了研究的向前發(fā)展，Nbs 在各種形式的診斷工具方面取得了很大的成功，例如 LFIA、診斷 ELISA、生物傳感器和體內(nèi)診斷成像，不僅用于疾病檢測(cè)，還用于檢測(cè)食源性病原體或環(huán)境毒素。因此，可以肯定的是，Nbs 將在未來(lái)幾年的下一代診斷工具和療法的開(kāi)發(fā)中發(fā)揮重要作用。