一．Western Blot實(shí)驗(yàn)原理
利用SDS-PAGE技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)多肽樣品直接進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移多肽/蛋白吸附到固相載體表面材料（如硝酸纖維素薄膜）上（以非共價(jià)鍵形式），并保持電泳分離的多肽/蛋白的類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上所附著的固定的蛋白質(zhì)/多肽分子片段作為載體抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再分別通過(guò)放射性同位素標(biāo)記載體上抗原的二抗起免疫結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)過(guò)熒光吸收顯色技術(shù)或熒光放射同位素自凝顯影等技術(shù)可以分離所得到目的蛋白。
 
二．Western Blot實(shí)驗(yàn)流程
（一）配膠：配置分離儲(chǔ)備膠，ddH2O 4.0 mL、30%儲(chǔ)備膠3.3 mL 1.5 M Tris-HCl 2.5 mL、10% SDS 0.1 mL、10%APS膠0.1 mL。取上述兩種混合液，加以TEMED(N'N'N'N'-四甲基乙二胺)10 μL封底，再加 TEMED 4 μL，混攪勻后灌人入玻璃板槽內(nèi)，再加約20%左右的乙醇封頂，注意勿使玻璃液面偏平。配置濃縮膠，ddH₂O 1.4 mL、30%儲(chǔ)備膠0.33 mL、1 M Tris-HCl 0.25 mL、10%SDS 0.02 mL、10%APS 0.02 mL、TEMED 2μL。將分離后膠杯內(nèi)壁上的殘存剩余的膠水液傾倒下去，加入了上述剩余的膠混臺(tái)液，立即用力將梳子輕輕插入玻璃板孔道間，完全聚合好后還需再放置大約15-30個(gè)min，在再插拔梳子時(shí)還要注意要防止有大量氣泡液體直接流進(jìn)入梳孔孔內(nèi)而導(dǎo)致使整個(gè)梳孔變形。
（二）樣品處理
1.培養(yǎng)的細(xì)胞（定性）
去除培養(yǎng)液細(xì)胞后一定要馬上用溫的PBS液反復(fù)沖洗每個(gè)細(xì)胞的2至3遍為止（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。對(duì)于6孔板來(lái)說(shuō)每一個(gè)孔都要再加200至300 uL，60至80℃1個(gè)×loading buffer。刮去除下去的細(xì)胞一定要先在EP管中煮沸約10 min，期間一定要渦旋震蕩2至3次。用最后一根清潔干凈后的針尖再次進(jìn)行挑絲，將團(tuán)塊絲全部棄掉，如果您發(fā)現(xiàn)沒(méi)有絲狀團(tuán)塊的存在但絲又有了明顯的拉絲現(xiàn)象的現(xiàn)象，可再考慮下將EP管置于0℃后在分別用14000至16000 g進(jìn)行離心和振蕩約2 min，再次進(jìn)行挑絲。若樣品上無(wú)明顯拉絲團(tuán)塊或者也是雖然無(wú)明顯白色絲狀物團(tuán)存在但樣品溶液里仍然會(huì)有些粘稠，可首先通過(guò)連續(xù)使用一支1 mL流量的注射器來(lái)進(jìn)行連續(xù)反復(fù)多次的抽吸試驗(yàn)來(lái)達(dá)到適當(dāng)降低樣品溶液粘滯度，便于在下次進(jìn)行上樣。待樣品溶液逐漸穩(wěn)定恢復(fù)樣品溫度穩(wěn)定到正常的室溫以下后再次上樣。
2.培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）
加入適量的冰預(yù)冷后的裂解液混勻后置于冰上10~20 min。刮除取下的細(xì)胞液后收集在EP管腔內(nèi)混勻后注入超聲。12000 g后進(jìn)行離心，4℃，2 min。取下的少量的上廓清液進(jìn)行定量。將以上的所有的蛋白樣品濃度均調(diào)至等質(zhì)量比的濃度,充分均勻的攪拌混合至沉淀后在滴加loading buffer溶液后如果再能直接地進(jìn)行上樣的反應(yīng)是最好,剩余的溶液（溶于1×loading buffer）后就完全可以繼續(xù)用低溫儲(chǔ)存。
3. 組織
心肝脾腎等臟器組織可考慮采用每50至100 mg再加1 mL裂解液，肺組織每100至200 mg后再酌情加用1 mL裂解液。可分別通過(guò)手動(dòng)攪拌或單獨(dú)用電動(dòng)攪拌機(jī)打勻成漿。注意攪拌機(jī)要注意盡量避免長(zhǎng)時(shí)間和保持較低溫，快速均勻攪拌才能勻漿。將所有混合的蛋白樣品溫度都調(diào)至一致濃度，充分加熱溶解混合蛋白沉淀液后在加滿loading buffer后再開(kāi)始直接加熱攪拌直到上樣濃度為最好，注意低溫儲(chǔ)存處理好后剩余蛋白溶液。
（三）SDS-PAGE電泳
上樣檢驗(yàn)工作完畢，在電泳槽溶液漏斗中加入電泳緩沖液，連接電源，負(fù)極在上，正極溶液在下。電泳時(shí)，濃縮溶膠電壓約為80 V，分離膠電壓大約是120 V，電泳繼續(xù)進(jìn)行至溴酚藍(lán)行至電泳橫條的下端停止。
（四）轉(zhuǎn)膜
1.前準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)移膜的緩沖液、轉(zhuǎn)膜時(shí)用的兩個(gè)小塑料夾子、兩塊塑料海綿墊、一只滴管、一張PVDF轉(zhuǎn)移膜、2大張濾紙。切濾紙膜板和濾膜時(shí)手均須要事先戴并帶好的一次性橡皮手套，PVDF濾膜板先切應(yīng)預(yù)先放置在稀甲醇的溶液中并充分浸泡至少5-10秒，接著再放入平衡液中平衡。
2.取出SDS-PAGE膠，將濃縮膠輕輕向上刮數(shù)下，在膠的一角處做標(biāo)記以方便區(qū)分上樣的順序。放在轉(zhuǎn)膜緩沖液槽中浸泡大約5分鐘以重新平衡離子強(qiáng)度。
3.夾子打開(kāi)并垂直平放到底部的一個(gè)黑色電極盒內(nèi)（陰極）的中間，放進(jìn)另有一張的黑色海綿墊片，用另一張玻棒子來(lái)回反復(fù)的搟打幾遍以幫助均勻地趕走氣泡。取出全部已均勻浸泡在轉(zhuǎn)膜液槽中的剩余凝膠并重新平躺地放在凝膠濾紙板片上，排除掉了所有殘余氣泡。將PVDF轉(zhuǎn)移凝膠膜置于聚丙烯酰胺轉(zhuǎn)移凝膠槽板上，玻棒一定要來(lái)回的刮壓幾遍以便能排除去的所有氣泡，注意一定須能在轉(zhuǎn)移凝膠膜槽板的最上端正面作上標(biāo)記（可以將膜的一角剪去或用簽字筆在膜的邊角上做記號(hào)）。在轉(zhuǎn)移膜板蓋上先應(yīng)先蓋好另一張已經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)移膜緩沖液槽浸泡及清洗處理過(guò)后的透明濾紙，亦是須確保轉(zhuǎn)移膜內(nèi)不留任何氣泡。最后再板蓋上應(yīng)另取另外一張透明海綿墊,蓋上陽(yáng)極板蓋（白色）后，夾緊，保證對(duì)凝膠層產(chǎn)生一定壓力。4.將夾子放入轉(zhuǎn)移膜槽中，轉(zhuǎn)膜時(shí)還需再將被轉(zhuǎn)移膜槽放入冰水中循環(huán)進(jìn)行。一般是用恒壓110 V轉(zhuǎn)移時(shí)間約在60 min。特別提示實(shí)驗(yàn)要保證低溫進(jìn)行。
(四）免疫學(xué)檢測(cè)
1.取膜，將此膜片的一端正面朝上在1xPBST溶液容器中輕輕上下?lián)u動(dòng)約五分鐘，洗三次，移至含有封閉液瓶（如含10%脫脂濃縮奶粉的瓶PBST緩沖液容器中保存；稱取脫脂濃縮的奶粉重量約是5 g，PBST約100 mL，溶解均勻后置于冰箱4℃小時(shí)以下保存。使用完畢取出時(shí)，恢復(fù)膜在室溫，用量輕輕蓋過(guò)此膜面即可。）放在密封良好的玻璃平皿瓶腔中，室溫狀態(tài)條件下放置在脫色搖床上搖動(dòng)并封閉保存超過(guò)1h。
2.取出膜在1xPBST溶液浴中搖動(dòng)清洗約5分鐘，洗三次，放入1xPBST緩沖液槽中培養(yǎng)（內(nèi)含5%脫脂牛奶），同時(shí)分別加入一抗與二抗到緩沖液槽中，孵育間隔60 min。
3.用1xPBST洗至少三次，5 min/次。
4.化學(xué)發(fā)光，顯影。 圖1 WB基本流程（來(lái)自卡梅德官網(wǎng)）
卡梅德生物在實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)上具有總結(jié)的技巧，有著嚴(yán)格質(zhì)控點(diǎn)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)念A(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置，能夠針對(duì)不同客戶的樣品量身定制不同的實(shí)驗(yàn)方案，并提供清晰、完整的Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果，節(jié)省客戶寶貴的科研時(shí)間，以高質(zhì)量滿足客戶需求。
 
三.傳統(tǒng)濕轉(zhuǎn)與半干轉(zhuǎn)的對(duì)比
100KD以下蛋白適用半干轉(zhuǎn)，且半干轉(zhuǎn)速率快。因?yàn)榘敫赊D(zhuǎn)的電流不會(huì)側(cè)漏，全都在濾紙之間，所以轉(zhuǎn)的效率比較高，速度快，缺點(diǎn)是有效離子濃度衰減快，可能大蛋白沒(méi)來(lái)得及轉(zhuǎn)上，產(chǎn)熱大可能被燒糊。
100KD以上的大分子蛋白的轉(zhuǎn)膜適合用濕轉(zhuǎn)方式，濕轉(zhuǎn)有效電流少，不全在濾紙之間，會(huì)從緩沖液間側(cè)漏，所以轉(zhuǎn)的效率低下，速度就慢了，但是有效離子濃度高，能夠長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

四.內(nèi)參抗體的選擇
(一）考慮實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)源
1.哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣本：常選用β-actin、β-tubulin、 GAPDH、 Lamin B、Histone H3、Na/K ATPase等。
2.植物來(lái)源的實(shí)驗(yàn)樣本，可以選擇plant actin、Rubisco等。
3.其他來(lái)源樣本研究較少，需要參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)選用合適抗體。
（二）目的蛋白的分子量大�。�
通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5 kDa以上。
（三）目的蛋白的表達(dá)部位：
一般實(shí)驗(yàn)主要是為了準(zhǔn)確檢測(cè)胞內(nèi)表達(dá)的特異性蛋白，選擇β-actin、 β-Tubulin、 GAPDH的抗體就可以了；而對(duì)于核蛋白的定量，特別是樣本來(lái)源于細(xì)胞核內(nèi)蛋白時(shí)，常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常見(jiàn)的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70、 K80等，在一些文獻(xiàn)報(bào)道中，Erk2、 TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c-Fos等都有使用；對(duì)于膜蛋白檢測(cè)，最常用的內(nèi)參抗體為Na/K ATPase；對(duì)于線粒體蛋白的檢測(cè)，常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。
 （五）Western Blot實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用
1.研究目的蛋白所處的細(xì)胞定位。蛋白的分選投遞與最終發(fā)揮生物功能是受基因活動(dòng)調(diào)控決定的綜合結(jié)果，因此改變了某些基因的活性，或化學(xué)修飾可能會(huì)影響其效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，改變細(xì)胞核質(zhì)中的分布，引發(fā)一系列不同的生物學(xué)效應(yīng)。
2.對(duì)基因的功能缺失研究。通過(guò)敲減或過(guò)表達(dá)目的基因后，用WB技術(shù)檢測(cè)相關(guān)通路蛋白的表達(dá)變化，以確定目的基因激活或抑制目的蛋白的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，探究信號(hào)通路。
3.檢測(cè)細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)：通過(guò)WB技術(shù)直接檢測(cè)干細(xì)胞分化、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、周期蛋白、DNA損傷修復(fù)、分子診斷標(biāo)志物等關(guān)鍵通路蛋白，可評(píng)估細(xì)胞或機(jī)體所處的生物學(xué)狀態(tài)。
4.藥物處理、代謝類的研究。
5.蛋白相互作用類的研究。通過(guò)WB可檢測(cè)Co-IP、RIP、CHIRP等實(shí)驗(yàn)的IP產(chǎn)物，研究目標(biāo)蛋白-蛋白，RNA-蛋白之間的相互作用。