藏紅花酸（crocetin）是藏紅花的主要活性成分之一，在中草藥、食用色素和染料工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。

研究表明，藏紅花酸及其衍生物有益于治療多種疾病，包括癌癥、冠心病和高血壓。目前，藏紅花酸可從藏紅花柱頭和梔子中提取、分離和純化，然而藏紅花年產(chǎn)量低、種植成本高(1公斤藏紅花的成本約為200美元)，同時(shí)，藏紅花中藏紅花酸等天然化合物的含量通常較低，這也導(dǎo)致了傳統(tǒng)提取和純化工藝的高成本。

幸運(yùn)的是，上述問題可以通過生物合成技術(shù)的發(fā)展來解決，但從頭生物合成實(shí)現(xiàn)藏紅花酸的商業(yè)化生產(chǎn)仍有很長的路要走，目前迫切需要一種更有效和可持續(xù)的生物合成藏紅花酸及其類似物的策略。

 

近日，來自天津大學(xué)的肖文海老師課題組在《ACS Sustainable Chemistry Engineering》發(fā)表了主題為“One-Pot Efficient Bioconversion of Crocetin from Zeaxanthin via a Dual-Enzyme System”的研究論文，首次創(chuàng)建了藏紅花酸的一鍋法體外合成方式。
 

通過優(yōu)化的蛋白表達(dá)和反應(yīng)系統(tǒng)，以及類胡蘿卜素裂解雙加氧酶2(CsCCD2-M1 (R192F/S323A))和醛脫氫酶(SynALD)組成的雙酶系統(tǒng)，從玉米黃質(zhì)中生物合成藏紅花酸。但是由于CsCCD2-M1和SynALD活性失衡，導(dǎo)致副產(chǎn)物3-HACA（3-hydroxy-β-apo-8′-carotenoic acid）的嚴(yán)重積累。研究人員進(jìn)一步通過以6∶1的摩爾比和優(yōu)化的雙酶反應(yīng)條件，完全去除了副產(chǎn)物3-HACA。最終將優(yōu)化后的體系放大10000倍后，在臺式生物反應(yīng)器（迪必爾生物）中進(jìn)行藏紅花酸的放大合成，結(jié)果顯示藏紅花酸的生物合成效率為1.48 mg/L/h, 2h內(nèi)轉(zhuǎn)化率為80.8%。此外，經(jīng)過三次循環(huán)后，殘余酶系統(tǒng)仍保留34%以上的酶活性。本研究不僅提供了一種可持續(xù)的體外生產(chǎn)藏紅花酸的方法，而且為快速構(gòu)建一鍋法合成具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的高價(jià)值化合物提供了新的思路。

 

具體的實(shí)驗(yàn)研究路線為：

1）CsCCD2-M1和SynALD表達(dá)系統(tǒng)的建立

 

溫度和誘導(dǎo)劑濃度是對蛋白可溶性表達(dá)的兩個(gè)關(guān)鍵因素，研究人員首先測試了CsCCD2-M1和SynALD在不同誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度下的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，表達(dá)CsCCD2-M1和SynALD的最佳IPTG濃度和溫度分別為0.1μM和16℃。分子伴侶的主要功能是防止新合成的多肽鏈和組裝的亞基聚集形成非功能結(jié)構(gòu)。同時(shí)，分子伴侶還參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、錯(cuò)誤折疊的降解和蛋白質(zhì)聚集的抑制，它在維持細(xì)胞內(nèi)蛋白穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。因此，研究人員嘗試將伴侶質(zhì)粒pGRO7與CsCCD2-M1和SynALD共表達(dá)，以提高它們的可溶性表達(dá)。如圖2a、b SDS-PAGE結(jié)果所示，分子伴侶蛋白的共表達(dá)顯著提高了CsCCD2-M1和SynALD的可溶性表達(dá)。最終，在誘導(dǎo)溫度為16℃、誘導(dǎo)劑濃度為0.1μM、添加分子伴侶的條件下，能夠有效地增強(qiáng)了蛋白的可溶性表達(dá)。
 

圖1 誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度對蛋白表達(dá)的影響

（a）不同濃度的IPTG對于CsCCD2-M1表達(dá)的影響

（b）不同溫度對于CsCCD2-M1表達(dá)的影響

（c）不同濃度的IPTG對于SynALD表達(dá)的影響

（d）不同溫度對于SynALD表達(dá)的影響

 

圖2 分子伴侶pGRO7對CsCCD2-M1和SynALD表達(dá)的影響

 

2）CsCCD2-M1催化條件的優(yōu)化

 

pH和反應(yīng)溫度是酶反應(yīng)過程中的兩個(gè)重要因素，此外，F(xiàn)e2+也是CsCCD2-M1催化活性中心的重要組成部分。因此研究人員通過調(diào)節(jié)pH、溫度和FeSO4的濃度來優(yōu)化CsCCD2-M1的反應(yīng)條件。向反應(yīng)系統(tǒng)中加入5μM的玉米黃質(zhì)，在不同的反應(yīng)條件下反應(yīng)2h，通過反應(yīng)前后玉米黃質(zhì)含量的變化來確定玉米黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化率。從圖3（b、c、d）中可以看出在30℃、pH 8.0和0.3μM Fe2+的添加量的條件下，藏紅花酸二醛的收獲率最高，同時(shí)將其確定為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件。
 

圖3 一鍋法合成途徑中CsCCD2-M1催化條件的優(yōu)化

（a）以玉米黃質(zhì)為底物的CsCCD2-M1反應(yīng)途徑

（b）pH對CsCCD2-M1活性的影響，實(shí)驗(yàn)溫度為30℃

（c）溫度對CsCCD2-M1活性的影響，實(shí)驗(yàn)pH為8.0

（d）鐵離子對CsCCD2-M1活性的影響，實(shí)驗(yàn)溫度和pH分別為30℃、8.0

 

3）用于一鍋法合成的CsCCD2-M1/SynALD雙酶調(diào)控模式

 

從玉米黃質(zhì)到藏紅花酸的生物合成途徑中最主要的兩步分別由CCD2和ALD催化完成。為了建立兩步反應(yīng)體系和確定最佳的底物-酶的添加比，研究人員在200μL的反應(yīng)體系中，加入5μM的玉米黃質(zhì)，然后添加1μM的CsCCD2-M1和SynALD，深入分析反應(yīng)6h內(nèi)底物和產(chǎn)物的變化。如圖4(a)所示，玉米黃質(zhì)被快速消耗，藏紅花酸和副產(chǎn)物3-HACA不斷積累；中間產(chǎn)物3-HAC也有少量積累，但隨即被迅速轉(zhuǎn)化。反應(yīng)2h后，底物玉米黃質(zhì)和中間產(chǎn)物3-HAC被完全消耗，反應(yīng)體系中只有最終產(chǎn)物藏紅花酸和副產(chǎn)物3-HACA，大約有17%的副產(chǎn)物未被轉(zhuǎn)化。然后，研究人員通過分析CCD2和ALD的作用機(jī)制，推導(dǎo)出如圖4（b）所示的反應(yīng)途徑，并進(jìn)行了相應(yīng)驗(yàn)證，最終分析副產(chǎn)物的產(chǎn)生可能是由于兩酶的催化活性不對等所致，并進(jìn)一步評估了CsCCD2-M1和SynALD的相對酶活性，如圖4（c）所示，SynALD的催化效率是CsCCD2-M1的6倍。當(dāng)CsCCD2-M1和SynALD以6:1的摩爾比加入時(shí)，3-HACA在2小時(shí)內(nèi)被消除(圖4d)。
 

圖4 藏紅花酸合成的最佳酶添加比

（a）以5μM的玉米黃質(zhì)為底物，添加1μM的CsCCD2-M1和SynALD，6h內(nèi)的反應(yīng)過程

（b）以玉米黃質(zhì)為底物體外合成藏紅花酸的過程

（c）順序添加1 μM的CsCCD2-M1和以5 μM玉米黃質(zhì)為底物的SynALD反應(yīng)過程。

（b）以5 μM玉米黃質(zhì)為底物，加入1 μM CsCCD2-M1和0.17 μM SynALD, 6 h內(nèi)的反應(yīng)過程。

 

4）一鍋法合成藏紅花酸的放大

 

基于上述優(yōu)化體系，研究人員將反應(yīng)體系放大100倍。在該反應(yīng)體系中，為了避免副產(chǎn)物3-HACA的產(chǎn)生，CsCCD2-M1和SynALD的添加比為6：1，最終計(jì)算出藏紅花酸的轉(zhuǎn)化率約為80.7%（圖5 b）。同時(shí)，為了降低反應(yīng)成本，提高酶在反應(yīng)體系中的利用率，研究人員將酶反復(fù)收集并利用（圖5 a），并對回收的酶進(jìn)行了活性檢測，如圖5b、c、d所示，三輪反應(yīng)中藏紅花酸的轉(zhuǎn)化率分別為80.7%、58.1%和34.1%。

   
為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)藏紅花酸的大規(guī)模生產(chǎn)，研究人員將反應(yīng)體系擴(kuò)大到10000倍至2.0L（圖6），并對目標(biāo)產(chǎn)物藏紅花酸進(jìn)行了分離、定量和表征。最終獲得5.92mg的藏紅花酸，其純度可達(dá)99%，且藏紅花酸的轉(zhuǎn)化率為80.8%，制備回收率為76.3%。

 

圖5 一鍋法合成藏紅花酸的多輪放大

（a）酶在反應(yīng)體系中回收的操作流程示意圖

（b-d）三輪以玉米黃質(zhì)為底物合成藏紅花酸的反應(yīng)

（e）藏紅花酸的LC-MS及1H NMR檢測結(jié)果

 

圖6 藏紅花酸在臺式反應(yīng)器（迪必爾生物）的放大合成

參考文獻(xiàn)：

Mengying Shan, Mingdong Yao, Ying Wang, Wenhai Xiao, and Ying-jin Yuan. One-Pot Efficient Bioconversion of Crocetin from Zeaxanthin via a Dual-Enzyme System. ACS Sustainable Chemistry & Engineering 2023 11 (23), 8615-8623