組織活性氧（ROS）檢測試劑盒（DHE）使用說明書
組織活性氧(ROS)檢測試劑盒（DHE）使用說明書
一、產品簡介：
組織活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DHE進行組織活性氧檢測的試劑盒。本試劑盒中的DHE ROS探針為紅色熒光的活性氧探針，具有510/610nm的最大激發(fā)/發(fā)射波長。DHE ROS探針在組織中活性氧存在的條件下，被氧化生成紅色熒光物質，紅色熒光強度與組織內活性氧水平成正比，檢測 DHE 產物的熒光強度就可以知道組織內活性氧的水平。 在激發(fā)波長510nm，發(fā)射波長610nm附近，使用熒光分光光度計、熒光酶標儀、等檢測DHE產物熒光，從而測定組織內活性氧水平。活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括過氧化氫（H2O2，Hydrogen peroxide）、羥基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、單線態(tài)氧（1O2，Singlet oxygen）、 一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧陰離子(•O2-，Superoxide anion)、過氧化自由基(ROO•，Peroxylradical)、過氧羥自由基（HOO•，hydroperoxyl）及其下游產物過氧化物過氧亞硝基陰離子（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。
活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生主要是氧化磷酸化的結果，在呼吸鏈中，在某些位點會有“泄露”的電子直接和氧氣或和其他電子受體反應，在酶或非酶作用下引發(fā) 一系列反應生成不同種類的活性氧：“泄露”的電子最初和氧氣反應生成超氧陰離子自由基（O2•-）。超氧陰離子遇水生成 H2O2，同時過氧化氫也可由氧氣在單 胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）的作用下生成，生成的過氧化氫在髓過氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）的催化下與 Cl-反應可生成ClO-，在鐵或銅離子的催化下發(fā)生Fenton反應生成OH•，超氧陰離子遇氮氧化物反應生成ONOO-。這些生成的高氧化活性的物質統(tǒng)稱為活性氧。
適用：新鮮組織， 一般最好使用新鮮組織樣本檢測活性氧，反映的是組織當時的活性氧狀態(tài)。凍存的組織樣本的ROS在長期凍存過程中會損失掉，有條件的話就使用新鮮樣本，不建議使用凍存的組織樣本。已經凍存的組織樣本中殘余的ROS也可以用本試劑盒檢測。
二、產品組成：
| 名稱規(guī)格 | 100T | 200T |
| 勻漿緩沖液 A | 100 ml | 2*100 ml |
| DHE 活性氧探針 | 200 μl | 2*200 μl |
| 說明書 | 一份 | |
三、自備材料：
1、熒光分光光度計或熒光酶標儀(激發(fā)波長488-535nm，發(fā)射波長610nm)
離心機，移液器，冰箱，冰盒
2、PBS 緩沖液（10mM,PH7.4 ）或者 HBSS
3、離心管，吸頭，一次性手套，熒光檢測專用黑色 96孔板
四、使用注意事項:
1、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。
2、DHE染色液為 DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。
3、使用前，先將本品取出回溫至室溫，并對其進行簡短離心使 DMSO溶液集中于管底。
4、盡量縮短探針標記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。
五、樣本處理：
1、剛取得的新鮮組織樣本用pbs洗凈.
2、準確稱取50mg組織，加入1ml勻漿緩沖液A，用玻璃勻漿器充分勻漿。
3、在100xg，4℃離心3分鐘，棄沉淀，取上清。
六、樣本檢測:
1、在96孔板中加入200微升勻漿上清液、2微升DHE 探針，用移液器吹打，使之充分混勻。
【注意】:
①不同樣本的活性氧差異較大，需要根據預實驗結果調整探針用量。一般加入2ul探針，染色終濃度按試劑盒中探針母液的100-2000倍稀釋，200-1000倍稀釋適合大多數樣本。最大稀釋比例可至2000倍。
②如果熒光強度太強，超過了檢測儀器的量程，可以減少探針用量。保證所有樣本探針用量一致即可。
③以酶標儀檢測為例。也可以用熒光分光光度計檢測，根據所使用儀器決定勻漿液體積和染色容器。
④染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。
⑤微量操作時，注意探針要有效加入勻漿液，避免沒有加入。
2、在37℃避光孵育15-30分鐘。
3、置于熒光酶標儀中，后于激發(fā)波長為488-535 nm、發(fā)射波長610 nm檢測熒光強度。
【注意】
①或使用熒光光度計等其它熒光檢測設備。
②必須使用熒光檢測專用的黑色96孔板。
③如果熒光強度太強，超過了儀器的檢測范圍，可以將孵育后的勻漿上清液稀釋后再檢測。一般稀釋5-50倍。
七、蛋白定量:
1. 另取50微升上清勻漿液，用PBS大約稀釋30倍。
2. 取100微升進行蛋白定量。
八、結果處理:
以熒光強度（RFU)/蛋白濃度（毫克蛋白）表示組織活性氧強度。
【注意】:
①數據與蛋白濃度的單位無關。
②此處以蛋白濃度數據作為校正系數，對不同樣品進行均一化處理。
③熒光強度強則活性氧（ROS）含量高。
④可以用實驗中對照樣本的熒光強度值為基準，待測組樣本的熒光強度值占對照樣本的百分比來比較活性氧（ROS）程度差異。
九、常見問題分析：
①活性氧結果如何分析?
ROS是多種物質的統(tǒng)稱，不像某一單一活性氧指標，無法檢測其絕對的含量，只能通過設置參照樣本，以參照樣本的倍數來反映目標樣本相對含量變化，這個“相對”是針對參照的。分析結果是定性的，也是沒有單位的，因為它本質上是一個比值（目標/參照)。反映的是模型樣本通過具體的干預措施（如養(yǎng)分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控等）如何影響其ROS的變化，測定其ROS是增加或者降低了。
②熒光強度在變化?
可以觀察到熒光的逐漸增加（由于自動氧化）或減少（由于細胞中的染料損失或光漂白)。在沒有任何刺激或誘導的情況下，健康的未經處理的樣本中的熒光突發(fā)可以指示細胞死亡或一些其他氧化事件的進展。
注意檢測時平行操作即可。
十、存儲：2-8℃保存
如果長期不用，勻漿液2-8℃保存，探針-20℃避光保存
十一、有效期：未拆封一年，拆封請盡快使用完
