期刊：ADVANCED SCIENCE
影響因子：17.521

導(dǎo)語
乳腺癌已成為全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，占女性癌癥的近30%。由于治療手段的快速發(fā)展，大多數(shù)非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者是可以治愈的。腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)是決定治療策略的重要臨床因素，在風(fēng)險評估和預(yù)后評估中也具有重要意義。

單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）是一個強(qiáng)大的工具，可以在單個細(xì)胞的分辨率下提供人類癌癥的表達(dá)譜�？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）是一種新型的生物技術(shù)，可以在組織切片中以空間分辨率進(jìn)行可視化和定量分析，彌補(bǔ)scRNA-seq中空間信息的不足。ST結(jié)合scRNA-seq有助于克服scRNA-seq（缺乏空間信息）和ST（不是單個細(xì)胞分辨率）的局限性。

研究技術(shù)
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，空間轉(zhuǎn)錄組測序

研究內(nèi)容
本研究利用單細(xì)胞RNA測序（ scRNA-seq ）和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對4例乳腺癌患者及其配對的腋窩轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的65，968個細(xì)胞進(jìn)行了分析。鑒定了一個具有高水平氧化磷酸化（OXPHOS）的播散性癌細(xì)胞簇。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)擴(kuò)散啟動時，糖酵解和OXPHOS之間會發(fā)生轉(zhuǎn)變。此外，這種獨(dú)特的細(xì)胞簇沿腫瘤前緣分布，后續(xù)對發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。

研究路線圖

研究結(jié)果
1. 乳腺癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶單細(xì)胞圖譜
為了全面鑒定原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤中的細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)，本研究對4例患者手術(shù)切除的4對原發(fā)浸潤性乳腺腫瘤和轉(zhuǎn)移腋窩淋巴結(jié)進(jìn)行了scRNA-seq（10x Genomics）。通過嚴(yán)格的質(zhì)量過濾，對剩余的65，968個細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞圖譜的構(gòu)建。通過聚類，所有的細(xì)胞被分為了0-15個cluster（圖1B），通過marker基因?qū)⑺�有�?xì)胞分為8種細(xì)胞類型，包括上皮細(xì)胞（ECAM1、KRT19、PROM1）、漿細(xì)胞（IGHG1、MZB1、SDC1）、髓系細(xì)胞（CD68、CD163、CSF1R、MRC1、TPSAB1、MS4A2、CD1C）、 NK細(xì)胞（NCR1、GLNY、NKG7）、B細(xì)胞（CD79A、CD79B、MS4A1）、T細(xì)胞（CD3D、CD3E、CD8A、CD4）、成纖維細(xì)胞（COL1A1、COL1A2、DCN）、內(nèi)皮細(xì)胞（PCAM1、VWF）（圖1C、D）。
 

Fig 1. 乳腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的單細(xì)胞圖譜

2. 通過scRNA-seq鑒定上皮細(xì)胞特征
由于癌細(xì)胞來源于上皮細(xì)胞，本研究對上皮細(xì)胞細(xì)分為了11個亞群。為了區(qū)分惡性細(xì)胞和非惡性細(xì)胞，本研究對于上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞亞群進(jìn)行了CNV水平的評估。在所有上皮細(xì)胞簇中，C3的CNV水平明顯低于其他細(xì)胞簇，表明C3是一組正常的乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，而其他細(xì)胞簇是惡性上皮細(xì)胞（圖2B）。為了解析乳腺癌上皮細(xì)胞的進(jìn)化動態(tài)，對上皮細(xì)胞的11個cluster進(jìn)行了擬時序分析。因?yàn)镃3為非惡行細(xì)胞，且在軌跡曲線的右下角，證明擬時序分析的右下角為起點(diǎn)。因此，C2、4和9被鑒定為早期擴(kuò)散的癌細(xì)胞（EDC）簇，因?yàn)樗鼈兾挥谲壽E曲線的末端，具有相對較高的CNV水平（圖2B、C）。更重要的是這三群在原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)樣本中均有出現(xiàn)。盡管C8的CNV水平較低，但因?yàn)槠湓谠�發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)樣本中均有出現(xiàn)，也被定義為EDC簇�？傊�，研究確定了C3代表正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，而C2、4、8和9是乳腺癌的EDC簇。

為了研究EDC簇（C2 ， 4 ， 8 ， 9）的基因表達(dá)變化，基于分子特征數(shù)據(jù)庫（Molecular Signatures Database，MsigDB）的Hallmarker基因集進(jìn)行富集分析，以識別癌細(xì)胞在傳播過程中的變化途徑。富集程度最高的通路包括與細(xì)胞增殖相關(guān)的通路（mTORC1 signaling、MYC targets V1）和乳腺癌治療反應(yīng)相關(guān)的通路（estrogen response early， estrogen response late），這些通路與患者的臨床病理特征和EDC簇更多的惡性特征相符。另外，EDC簇顯示OXPHOS途徑的顯著富集，暗示擴(kuò)散細(xì)胞的新的代謝特征（圖2D）。

熱圖（圖2E）顯示了細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)變化。其中在惡性上皮細(xì)胞早期播散過程中，OXPHOS （COX6C、DHRS2、ATP5MC2和NDUFB4）中的標(biāo)記基因呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)模式，而糖酵解途徑中的標(biāo)記基因（GAPDH、LDHA、PKM和PGK1）呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的表達(dá)模式。同時，與細(xì)胞粘附和遷移相關(guān)的基因（CLDN3， F11R）的表達(dá)也呈現(xiàn)先下降后上升的模式，這表明了癌細(xì)胞在擴(kuò)散過程中細(xì)胞行為的動態(tài)變化。乳腺癌細(xì)胞的這種代謝轉(zhuǎn)換類似于轉(zhuǎn)移過程中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的變化，即從原發(fā)腫瘤脫離后，EDCs的代謝輪廓從糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)镺XPHOS。一旦轉(zhuǎn)移細(xì)胞形成，代謝偏好又恢復(fù)為促進(jìn)細(xì)胞增殖�？傊�，我們的研究結(jié)果揭示了乳腺癌早期轉(zhuǎn)移過程中OXPHOS和糖酵解之間的轉(zhuǎn)變，表明OXPHOS可能在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。
 

3. 細(xì)胞通訊分析揭示EDCs與免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞間配體-受體對
為了鑒定EDC與免疫細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，本研究對EDC和免疫細(xì)胞做了cellchat分析。雖然在原發(fā)腫瘤中主要細(xì)胞類型之間的相互作用數(shù)量較高，但兩組之間的相互作用強(qiáng)度非常接近（圖3A）。EDC簇在原發(fā)腫瘤中表現(xiàn)出與免疫細(xì)胞更多的相互作用，而在淋巴結(jié)中表現(xiàn)出與免疫細(xì)胞更強(qiáng)的相互作用（圖3B-E）。

接下來研究了不同細(xì)胞簇之間的特異性配體-受體相互作用。免疫細(xì)胞之間的配體-受體對（CD22 - PTPRC、PTPRC - CD22和ADGRE5 - CD55）在淋巴結(jié)相比于原發(fā)腫瘤中顯著上調(diào)，表明這些途徑對于腫瘤的免疫反應(yīng)至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）通路在EDCs和免疫細(xì)胞之間的淋巴結(jié)和原發(fā)腫瘤中都很活躍，表明它在這兩個部位都是必不可少的，并且可能有助于乳腺癌的傳播（圖3F-H）。20條通路中，有4條通路在原發(fā)和轉(zhuǎn)移中都活躍，其他的一些通路分別存在淋巴結(jié)或者原發(fā)腫瘤中（圖3I）。
 

Fig 3. EDCs細(xì)胞通訊

4. 空間轉(zhuǎn)錄組測序聯(lián)合單細(xì)胞測序解釋EDC的空間特征
為了進(jìn)一步評估上皮細(xì)胞的空間組織，從4例患者的原發(fā)新鮮腫瘤樣本中進(jìn)行乳腺癌組織冰凍切片。經(jīng)蘇木精-伊紅（H & E）染色和明場成像后，將玻片注釋為3個主要區(qū)域，包括腫瘤區(qū)域、導(dǎo)管上皮和基質(zhì)區(qū)域（圖4A左）。為了詳細(xì)探究EDC簇的空間特征，利用t - SNE分析對ST數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，將所有spot劃分為15個Cluster（圖4B）。通過將所有ST簇投射到冰凍切片上，研究發(fā)現(xiàn)了一個明顯的分布模式，這與H & E染色（圖4A ，右）下的組織學(xué)注釋一致。對于每個樣本，腫瘤區(qū)域由不同的簇組成，包括來自T1的CII，來自T2的CX和CXIV，來自T3的CIX和CXIII，來自T4的CVIII和CXV。這些結(jié)果暗示了4例患者之間的腫瘤異質(zhì)性。為了精確定位樣本中的上皮細(xì)胞，應(yīng)用MIA生成上皮簇和ST簇的對應(yīng)關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)EDC簇（C2，C4，C8，C9）在腫瘤區(qū)域富集。有趣的是，我們注意到在T3和T4中，EDC簇C2和C8主要位于腫瘤區(qū)域的前沿，而在T3中，另一個惡性細(xì)胞（C6）被C8包圍。結(jié)合偽時間分析的結(jié)果，推測從惡性階段（C6）到播散階段（C8）的演變與從腫瘤內(nèi)部到前緣最后到轉(zhuǎn)移部位的路線平行。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，手動選取了每個樣本腫瘤前緣的斑點(diǎn)。對不同樣本進(jìn)行了BMS、OXPHOS、EMT評分，盡管在四個樣本中三個評分有差異，但在每個樣本中，三個評分在腫瘤前緣顯示出明顯高于腫瘤內(nèi)部區(qū)域（圖4D、E）。這些結(jié)果表明EDC簇的分布遵循腫瘤前沿，這與MIA產(chǎn)生的結(jié)果以及scRNA-seq鑒定的EDC簇代謝特征一致。

為了進(jìn)一步研究腫瘤前沿的EDCs，我們對T3和T4的ST數(shù)據(jù)進(jìn)行了t - SNE分析，將每個樣本的spot點(diǎn)重新聚類為9個簇和5個簇 （圖4F，左）。BMS評分最高的兩個簇（C2在T3，C4在T4）在兩個樣本中均沿腫瘤前緣分布（圖4F中、4G）。根據(jù)scRNA - seq的結(jié)果，COX6C和DHRS2在EDC簇和其他上皮簇之間的前25個差異基因中，均參與OXPHOS途徑。正如預(yù)期的那樣，在兩個樣本中，COX6C和DHRS2水平最高的兩個簇沿腫瘤前緣分布，這與MIA產(chǎn)生的結(jié)果一致。

GSVA 分析腫瘤前沿spot與腫瘤區(qū)域其他spot之間的差異通路。GSVA結(jié)果顯示OXPHOS通路在腫瘤前沿的spot中顯著上調(diào)。此外，其他富集通路如DNA修復(fù)通路、MYC靶點(diǎn)V1通路和mTORC1信號通路在EDC簇中也顯著上調(diào)。綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)EDC簇趨向于沿腫瘤前緣分布，并表現(xiàn)出OXPHOS上調(diào)的代謝特征。OXPHOS可能在EDC簇的代謝轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。
 

Fig 4. EDC的空間特征
 

5. 敲除COX6C和DHRS2可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和EMT評分
使用不同的人乳腺癌細(xì)胞系敲除了氧化磷酸化通路中的關(guān)鍵基因COX6C和DHRS2基因，并結(jié)合transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、免疫組化（IHC）、WB實(shí)驗(yàn)等，發(fā)現(xiàn)敲除COX6C和DHRS2可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和EMT評分。
 

Fig 5. 敲除COX6C和DHRS2抑制乳腺癌細(xì)胞增殖
 

6. Oxphos的上調(diào)與乳腺癌患者的淋巴結(jié)狀態(tài)和預(yù)后相關(guān)
作者接下來用自己的FUSCC隊(duì)列數(shù)據(jù)和TCGA數(shù)據(jù)庫相結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性樣本在OXPHOS通路上得分更高，在糖酵解途徑得分更低。scRNA-seq公共數(shù)據(jù)集分析驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)OXPHOS通路、雌激素信號通路和tight junction通路在EDC細(xì)胞中富集。TCGA生存分析發(fā)現(xiàn)，在HER2陽性乳腺癌中和基底樣乳腺癌中，COX6C和DHRS2與較差的OS（overall survival）和DMFS（distant metastasis-free survival）相關(guān)。
 

Fig 6. 氧化磷酸化與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后呈正相關(guān)
 

參考文獻(xiàn)：
Liu Y M, Ge J Y, Chen Y F, et al. Combined Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveal the Metabolic Evolvement of Breast Cancer during Early Dissemination[J]. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany), e2205395.