制藥工業(yè)的飛速發(fā)展，特別是蛋白質(zhì)治療藥物，如單克隆抗體、酶、細胞因子、反應(yīng)器融合蛋白等，非治療性過程疫苗、細胞治療、基因治療和生物仿制藥的審批上市，對生物反應(yīng)器的應(yīng)用需求日益增加。生物反應(yīng)器通過維持細胞等生物適宜的環(huán)境以提供良好的生長條件確保溫度、pH、有效的底物、營養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧的運輸來支持這個自然過程，使細胞能進行生長和表達。生物反應(yīng)器的設(shè)計中獲得確保細胞生長和表達的上述參數(shù)是至關(guān)重要的，特別在實驗室規(guī)模轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)規(guī)模，必須關(guān)注考慮到規(guī)模間差異的影響。

細胞培養(yǎng)的限制因素之一--氧氣

溶氧（DO)是溶解氧（Dissolved Oxygen）的簡稱，是表征水溶液中氧的濃度的參數(shù)，是溶解在水中的游離態(tài)氧。水中溶解氧含量的變化情況：一種是使DO下降的耗氧作用（OUR），包括細胞生長、代謝、表達的耗氧；另一種是使DO增加的溶氧作用（OTR），有空氣中氧的溶解，曝氣手段等。這兩種作用的相互消長，使水中溶解氧含量呈現(xiàn)變化。影響水中溶解氧的含量的環(huán)境因素有溶液溫度，壓力，培養(yǎng)液濃度等因素。

在哺乳動物細胞生物反應(yīng)器中，特別是在高細胞密度下操作時，通氣是一個關(guān)鍵組成部分。氧是難溶氣體，在1atm，20ºC時，氧在純水中的溶解度約為0.25mmol/L。細胞對氧氣的需求包括：

葡萄糖代謝，細胞生長和蛋白表達

細胞對物質(zhì)需求量看出，相較其它主要的營養(yǎng)成分，如果不及時增加溶解氧則氧氣總是最先被耗盡。哺乳細胞的耗氧速率(Oxygen Uptake Rate, OUR)約為10-13mol/cell-h，在10x10⁶cell/ml細胞密度的培養(yǎng)基中，幾秒鐘后培養(yǎng)液中溶氧將降為零，氧氣供應(yīng)不足是未達到所需細胞培養(yǎng)濃度的常見原因之一。故細胞對氧氣的高需求量和氧氣在培養(yǎng)基中的低溶解度，溶解氧傳遞成為細胞培養(yǎng)關(guān)注的關(guān)鍵參數(shù)。

細胞培養(yǎng)時將除菌后的空氣進入反應(yīng)器中，使之分散成細小的氣泡，盡可能增大氣泡接觸面積和接觸時間，以促進氧的溶解。為了確保足夠的氧氣供應(yīng)強度，必須正確設(shè)計生物反應(yīng)器，并提供適當(dāng)?shù)幕旌虾推貧饽Ｊ健?strong>K_La參數(shù)用于表征氧氣傳質(zhì)。
 

體積氧傳質(zhì)系數(shù)K_La

K_La以數(shù)字方式顯示了通過容器中的分布器引入的氧氣通過混合器在介質(zhì)中消散和分布的效率，該概念源于雙膜理論，假設(shè)兩相之間的傳質(zhì)是通過兩相之間的邊界層發(fā)生的。

組分在相之間的擴散速率取決于傳質(zhì)系數(shù)，對于液體，該系數(shù)通常寫為“k_L”，兩相之間的接觸面積，通常稱為“a”。我們得到體積氧傳質(zhì)系數(shù)K_La，作為控制氧氣從氣相轉(zhuǎn)變?yōu)橐合嗟乃俾实膮��?shù)。用以下公式來描述：

 dC/dt = K_La ∙ (C*-CL) = OTR – OUR

 

CUR激流式反應(yīng)器如何提高K_La

接液面積

CUR激流式反應(yīng)器中的液體形成類似渦柱流，細胞能隨液流沿內(nèi)壁向上爬升，形成的渦柱流擴大了氣液交換面積，并且大部分培養(yǎng)基都在罐內(nèi)壁一側(cè)，另一側(cè)形成液膜，即能形成通氣面和沖刷面雙面液膜。配合錐形底部設(shè)計有效增大氣液交換效率。

轉(zhuǎn)速

在相同工作體積下，隨著轉(zhuǎn)速上升，湍能耗散率和氣液交界面面積均呈增大趨勢，湍能耗散率有助于K_L提高，氣液交界面a也增加，故隨著轉(zhuǎn)速上升，K_La也是呈增大趨勢。

體積 

由于相同體積培養(yǎng)液在錐低形反應(yīng)罐中具有較高的液面高度，從而氣體在培養(yǎng)液中的停留時間增加，即增加了供氧能力。

CUR激流式反應(yīng)器的K_La測試

基于通過亞硫酸鈉溶液的氧化來測定曝氣容器中的氧氣轉(zhuǎn)移速率：

2Na₂SO₃ + O₂ = 2Na₂SO₄

當(dāng)氧氣進入溶液時，它立即在亞硫酸鹽的氧化反應(yīng)中被消耗，因此亞硫酸鹽的氧化速率相當(dāng)于OTR，溶解氧濃度為零，K_La可由下式計算：

OTR =K_La（C*-C) =QM/2V

Q-流加Na₂SO₃溶液的速度（L/h)

M-加入NaSO₃溶液的濃度

V-反應(yīng)器內(nèi)液體體積（L）

利用溶氧電極測定C/C*后，可按以下公式方便地計算K_La值。

K_La=QM/[2VC*(1-C/C*)]

各規(guī)格CUR（CUR2.5、CUR5、CUR50）在滿載體積、0.01vvm通氣條件下的體積溶氧系數(shù)（K_La）

測試結(jié)果表明，在同一通氣量條件下：

• 隨著振蕩轉(zhuǎn)速的提高，K_La測試值整體呈上升趨勢；

• 生物反應(yīng)器規(guī)格增大，在測定的轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)K_La測試值呈上升趨勢；

• 在相同的轉(zhuǎn)速增幅下（5rpm增幅），CUR50在三者中的KLa測試值增幅最大。
   

不同類型反應(yīng)器在各轉(zhuǎn)速下的K_La

文獻中對不通氣條件下，激流式反應(yīng)器的K_La比對平底式反應(yīng)器、攪拌式反應(yīng)器試驗數(shù)據(jù)結(jié)論描述如下圖，充分證實CUR激流式反應(yīng)器的交界面?zhèn)餮鯔C制對提高K_La有顯著優(yōu)勢。_【1】

KLa of different bioreactors in different rotation or mixing speed

▲激流式生物反應(yīng)器   ♦平底式反應(yīng)器   ■攪拌式反應(yīng)器


 

CUR反應(yīng)器在氧氣傳遞方面優(yōu)勢

氣液交接面積大，效率高，傳質(zhì)效果好

只需頂部通氣無需底通即可滿足生長需要

利于CO₂的溢出

倒置截頭圓錐形罐體，比表面積大，流場穩(wěn)定

 

參考文獻 

【1】白力, 張淑香, 唐寅, 郭美錦, 張嗣良. 錐底生物反應(yīng)器的動物細胞培養(yǎng)[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）, 2008, (3): 338-341.