研究結(jié)果
1. 定制微凝膠，以及在定制微凝膠的軟骨和成骨分化
為了給MSC在軟骨和成骨分化提供合適的微環(huán)境，將透明質(zhì)酸(HA)和羥基磷灰石(HYP)分別加入到基于凝膠化的前體溶液中，經(jīng)冷凍、鋪板、洗滌和凍干后形成CH-微凝膠和OS-微凝膠。將MSCs接種到定制的CH-微凝膠和OS-微凝膠中，然后分別在成軟骨和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，形成預(yù)分化的負(fù)載細(xì)胞的定制微凝膠。預(yù)分化的軟骨和成骨微凝膠依次沉積成兩層，通過自組裝形成骨軟骨類器官。
 

2. 將定制的微冷凍凝膠自組裝成骨軟骨類器官
將CH-微凝膠和OS-微凝膠分別進(jìn)行7天的軟骨和成骨分化誘導(dǎo)，然后將預(yù)分化的微凝膠移液到4 mm長(zhǎng)的網(wǎng)狀框架中，接著在混合骨軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天(軟骨分化:成骨分化= 1:1)。在試管內(nèi)預(yù)分化微凝膠自組裝成軟骨類器官。
 

在成骨方面，在成骨誘導(dǎo)7天后，比較了在對(duì)照微冷凍液和OS微冷凍液中生長(zhǎng)的MSCs。分析共2158個(gè)下調(diào)的DEGs和3213個(gè)上調(diào)的DEGs。GO分析發(fā)現(xiàn)10個(gè)上調(diào)的GO術(shù)語(yǔ)與成骨細(xì)胞分化、骨化、骨發(fā)育、骨生長(zhǎng)和骨礦化有關(guān)。PPI分析顯示了骨再生相關(guān)通路的顯著聚集，如軟骨細(xì)胞分化、軟骨發(fā)育和TGF-β受體信號(hào)通路。KEGG分析顯示，與骨發(fā)育(包括PI3K-Akt、FoxO、TGF-β、MAPK和Wnt信號(hào)通路)和免疫調(diào)節(jié)(mTOR、TNF和IL-17信號(hào)通路)相關(guān)的通路顯著上調(diào)，而凋亡相關(guān)的p53信號(hào)通路顯著下調(diào)。GSEA分析顯示，COL1A在MAPK活性的激活、骨細(xì)胞發(fā)育、TGF-β產(chǎn)生和血管相關(guān)平滑肌收縮中上調(diào)，在巨噬細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)中下調(diào)。RUNX2在脂肪酸β氧化的調(diào)節(jié)和對(duì)TGFβ的反應(yīng)中上調(diào)，在單核細(xì)胞分化，正向調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化，正向調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞分化中下調(diào)。
 

4. 自組裝骨軟骨類器官對(duì)體內(nèi)骨軟骨缺損的影響
采用比格犬股骨缺損模型，研究了預(yù)分化定制微冷凍凝膠自組裝形成的軟骨類器官對(duì)體內(nèi)治療骨軟骨缺損的影響。注釋定制的微凝膠后立即完全填充缺損，隨后原位自我定向組裝成軟骨類器官。術(shù)后6個(gè)月，對(duì)照組的比格犬表現(xiàn)出明顯的跛行，而微凝膠治療組表現(xiàn)出步態(tài)的明顯改善，盡管有輕度的殘余跛行。骨軟骨類器官干預(yù)組表現(xiàn)出標(biāo)準(zhǔn)步態(tài)。MRI 圖像（紅色箭頭表示修復(fù)組織的區(qū)域）顯示術(shù)后3個(gè)月，所有缺損組均未被新組織完全填充，軟骨下骨也出現(xiàn)一定程度的炎癥和水腫。在對(duì)照微凝膠和軟骨類器官組中觀察到更連續(xù)的修復(fù)組織信號(hào)。在12個(gè)月時(shí)，軟骨下骨的水腫在未治療的對(duì)照組和對(duì)照組微凝膠組中仍然明顯，但在軟骨類器官組中幾乎完全消失。此外，缺損僅在軟骨類器官組中被完全填充，顯示出與周圍正常軟骨相比具有高度相似性的光滑和均勻的修復(fù)組織。
 

參考文獻(xiàn)：
Yang Zhen,Wang Bin,Liu Wei et al. In situ self-assembled organoid for osteochondral tissue regeneration with dual functional units.[J] .Bioact Mater, 2023, 27: 200-215.