本文要點：具有NIR-II窗口熒光發(fā)射的熒光探針由于其成像深度的增加而得到了廣泛的研究。然而，目前報道的NIR-II熒光探針存在合成路線復雜、熒光量子產率(QYs)低等缺點。在NIR-II探針的研制中可采用屏蔽策略來提高其量子產率，但目前這種策略僅用于對稱的NIR-II探針的設計，特別是那些基于苯并[1,2-c:4,5-c ']雙([1,2,5]噻二唑)(BBTD)骨架的探針。本文報道了一系列基于屏蔽策略的不對稱NIR-II探針，這些探針具有合成路線簡單、高合成率(90%以上)、高QYs和大斯托克位移等優(yōu)勢。進一步使用D-α-生育酚基聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)作為NIR-II熒光探針(NT-4)的表面活性劑，以提高探針的水溶性，得到TPGS-NT-4 NPs。體內研究表明，具有高QY(3.46%)的TPGS-NT-4 NPs可實現(xiàn)高分辨率的血管造影和有效的局部光熱治療，同時具有良好的生物相容性。本文通過結合血管造影和局部光熱治療來提高腫瘤對納米光熱劑的吸收，同時減少其對正常組織的損傷。

 

 

---

背景：近紅外窗口（NIR；700-1700 nm）的熒光團在腦血流和腫瘤微環(huán)境的探測中可以提供高對比度的圖像。但NIR-I熒光團（NIR-I，700-900 nm）臨床應用受到其穿透深度不足（約0.22 mm）的阻礙，NIR-II熒光團（NIR-II，1000-1700 nm）具有更深的穿透深度（約3 cm）、更大的空間分辨率（約100 nm）和良好的信噪比（SBR）等特性，因此，探針的激發(fā)波長從NIR-I到NIR-II的深色位移將提高探針的組織穿透深度。

 

迄今，已報道的有機NIR-II探針根據(jù)其化學工程策略可分為兩大類：1）結構與花青染料相似的NIR-II探針；2）基于BBTD的供體-受體-供體（D-A-D）熒光團。有機NIR-II熒光團往往由于其分子內和分子間相互作用的堆積而導致熒光淬滅，量子產率低�？梢酝ㄟ^提高空間位阻來防止聚集進而提高量子產率，如采用屏蔽策略。屏蔽策略指的是添加一個官能團，使分子骨架扭曲，從而增加分子間空間位阻，減少分子內和分子間的相互作用，進而減少分子激發(fā)態(tài)向周圍水分子的能量轉移。Dai的研究小組首次引入了通過交替屏蔽單元、電子給體和受體設計的具有更高QY的NIR-II探針。噻吩及其衍生物EDOT近年來也常常用于探針的設計，可作為熒光團的第二給體以及橋接基團。值得注意的是，EDOT被證明在獲得適當?shù)姆肿踊�變和基于屏蔽策略提高NIR-II熒光團的QYs方面優(yōu)于噻吩。本文分別使用噻吩和EDOT作為第二給體和橋接分子來構建NT-1和NT-2熒光團。結果顯示NT-2與EDOT在DCM中的QY為6.31%，比NT-1(Scheme 1)高1.8倍。

 

Scheme 1

 

另一種提高QY的創(chuàng)新策略是電荷屏蔽效應，即通過引入兩性離子電荷來減少分子的凈電荷。還可以通過疏水或疏水分支屏蔽熒光團的分子結構來減少熒光團與水分子之間的相互作用。本文在熒光團的設計中采用疏水受體（1,8-萘內酰亞胺）來達到上述目的。同時，1，8-萘內酰亞胺還可以有效地將熒光紅移到NIR-II窗口。雙鍵的增加也有利于π-共軛體系的拓展，本文通過增加橋聯(lián)雙鍵來進一步使熒光團的發(fā)射紅移，并得到了熒光團NT-3和NT-4（Scheme 1）。

 

此外，構建高產、合成簡單、副產物少的的NIR-II探針對于臨床轉化是很重要的。與以往報道的對稱D-A-D NIR-II熒光團相比，本研究設計的NIR-II熒光團系列(NT-1、NT-2、NT-3、NT-4)的合成路線簡單，產率超過90%，且具有不對稱D-π-A結構。根據(jù)已有的報道，不對稱結構的能量遷移是部分可逆的，這對于減少熒光團的光漂白有利。這也就進一步賦予分子恰當?shù)撵`活性和熒光強度/熒光持久范圍，以更好地滿足血管造影的需要，并提供更好的空間分辨率和對比度，以解決微血管分布和進行灌注分析。

 

基于分子設計策略和實驗結果，NT-4被作為后續(xù)研究的候選物。為了提高其溶解度和細胞滲透性，進一步用TPGS（被FDA批準的具有抗氧化和抗炎作用）包封NT-4。TPGS使熒光團具有隱身效果。水中TPGS-NT-4 NPs的QY為3.46%，與已有報道的NIR-II探針的QY相比處于中上水平，滿足NIR-II熒光成像的要求。體內血管造影實驗顯示，TPGS-NT-4 NPs是一種有效的NIR-II成像探針。尾靜脈注射TPGS-NT-4 NPs后，裸鼠后肢血管的高斯半峰寬度(FWHM)為495 μm，濾光率為1300 LP, SBR為2.57。此外，通過右股動脈局部注射TPGS-NT-4 NPs可以很好地顯示腫瘤血管。

 

毫無疑問，將納米藥物有效地輸送到腫瘤組織，同時減少對正常組織的損傷是一項艱巨的挑戰(zhàn)。本研究通過結合血管造影和局部光熱治療來提高納米光熱劑對腫瘤的吸收，同時減少其對正常組織的損傷。在NIR-II熒光引導下局部注射TPGS-NT-4治療劑量，然后進行光熱治療。在輻照期間產生的健康組織損傷將大大減少。H&E染色證實了TPGS-NT-4 NPs具有良好的生物相容性。隨后，本文還研究了TPGS-NT-4 NPs的光熱性質。實驗結果證實TPGS-NT-4 NPs具有良好的光熱隔熱性能和優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性。體內光熱治療實驗也進一步證實TPGS-NT-4 NPs具有開發(fā)用于局部治療的光熱劑的潛力。

 

實驗內容：

 

1）探針的合成、表征及光學性質研究

通過選擇低電子密度受體(化合物10)和高電子密度給體(4-乙基- N, N -二甲基苯胺)，并以噻吩為橋接結構，設計了探針NT-1的不對稱D-A結構。NT-1的合成通過一個簡單的過程完成(圖1A)。合成反應的產率為92%，與目前報道的NIR-II熒光探針相比，收率非常高。根據(jù)已報道的研究，采用屏蔽策略可以有效地提高NIR-II探針的QYs，這是由于共軛主鏈阻礙了分子間相互作用或阻止了聚集。據(jù)此，本文設計并合成了以EDOT取代噻吩的NT-2。EDOT作為第二給體和橋接基團具有扭曲分子骨架的作用，從而降低分子間的相互作用。NT-3和NT-4是通過延長雙鍵來獲得發(fā)射波長的紅移而得到的。NT-2、NT-3、NT-4的收率也較高，分別為92%、90%、91%。用1H NMR、13C NMR和質譜對這4個化合物進行了表征，證實了結構的正確性。

Figure 1

 

對NT-1、NT-2、NT-3和NT-4的光學性質進行深入的研究。如圖1A-D所示，四種小分子化合物在近紅外窗口均有吸收，四種化合物在DCM中的最大吸收波長分別為840、860、880和915 nm。此外，隨著溶劑極性的增加，四種探針的紫外-可見吸光度都出現(xiàn)了顯著的藍移效應。有趣的是，在含有10% DMSO的水溶液中，這四種化合物的吸收都藍移到約650 nm。推測光譜藍移是由于這四種化合物的水溶性差，它們都是大的共軛體系，聚集在極性溶劑中。

 

隨后，在808 nm光激發(fā)下，四種探針的熒光發(fā)射都在NIR-II窗口，特別是在DCM和DMSO中(圖1E-H)。四種化合物單體的最大熒光發(fā)射波長分別在1095、1050、1130和1110 nm處，而探針的低聚物在1200 nm處有一個肩峰。具有大斯托克斯位移的探針在生物成像中具有更高的信噪比(SBR)，四種化合物的Stokes位移分別為287、242、322和302 nm。本文還簡要分析了四種分子結構的LUMO和HOMO軌道。四種探針的HOMOs均沿共軛主鏈離域，而LUMOs主要位于受體上。與NT-1和NT-3相比，含有EDOT的探針(NT-2和NT-4)表現(xiàn)出較少的離域LUMOs，并且可以調節(jié)靜電勢能的分布(圖1B)。比較NT-2和NT-4，NT-4的雙鍵延伸后吸收能降低，因此其吸收有明顯的紅移趨勢，這與實驗結果一致。以IR-26在1,2-二氯乙烷(DCE)中的含量為基準，計算了四種探針的相對QY。NT-1、NT-2、NT-3和NT-4在DCM中的QY分別為3.48%、6.31%、2.75%和4.08%。值得注意的是，在相同的測試條件下，由于引入了EDOT, NT-2和NT-4的熒光強度要高于NT-1和NT-3。產生這種實驗現(xiàn)象的原因可能是由于EDOT的扭曲結構減少了分子間的相互作用。基于四種探針的光學性質，本文選擇NT-4作為研究對象，對這種結構不對稱的NIR-II探針進行進一步的修飾和研究，得到TPGS-NT-4 NPs，其熒光量子產率處于中等以上水平。

 

2）TPGS-NT-4 NPs的制備、表征及性能研究

由于NT-4的水溶性較差，選擇兩親性生物材料D-α-生育酚基聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)對探針進行包封，使其具有生物學應用價值。通過薄膜水合法制備了負載NT-4的納米顆粒(TPGS-NT-4 NPs)，并通過透析去除未包封的NT-4。接著對TPGS-NT-4的結構進行了表征，并對其理化性質進行了研究。如圖2A所示，TPGS-NT-4 NPs的粒徑約為15.37 nm，納米顆粒呈電中性。通過透射電鏡(TEM)表征了TPGS-NT-4 NPs的形態(tài)和大小。納米顆粒呈球形，具有光滑均勻的形貌(圖2D)。TPGS-NT-4 NPs的最大紫外可見吸收波長為805 nm。圖2B顯示，TPGS-NT-4 NPs與NT-4在DMSO中的紫外-可見吸收相似。這一實驗現(xiàn)象證明，TPGS的包封顯著提高了NT-4的水溶性。TPGS-NT-4 NPs的納米包封率為84%。TPGS-NT-4 NPs的最大熒光波長為1020 nm，以IR-26為標準測定的QY為3.46%(圖2C)。TPGS-NT-4 NPs的Stokes位移為212 nm。同時，對納米顆粒的穩(wěn)定性進行了研究。如圖2E和F所示，室溫下放置15天后，TPGS-NT-4 NPs的溶液狀態(tài)、紫外可見吸收光譜和納米顆粒大小均無顯著差異，表明TPGS-NT-4 NPs在室溫下具有良好的穩(wěn)定性。

Figure 2

 

3）TPGS-NT-4 NPs的NIR-II血管成像研究

首先，通過MTT實驗證實了NT-4和TPGS-NT-4 NPs在高濃度下對細胞沒有毒性。為了證明TPGS-NT-4 NPs可以作為一種新的NIR-II探針用于全身血管成像，對Balb/c裸鼠進行全身和腦血管成像。裸鼠靜脈注射TPGS-NT-4 NPs (200 μL, 0.5 mg/mL) (n = 3)。采用不同濾光片(900 LP、1000 LP、1100 LP、1300 LP)，通過InGaAs相機記錄裸鼠NIR-II圖像。注射TPGS-NT-4 NPs后10分鐘顯示NIR-II血管成像。為了更好地評價TPGS-NT-4 NPs血管成像效果，本研究選擇對腿部血管進行局部血管成像。如圖3A和B所示，在相同的曝光時間(400 MS)下，TPGS-NT-4 NPs在NIR-II窗口1300 LP下的成像分辨率更高。同時，對高斯半頻全寬(FWHM)和信噪比(SBR)進行分析。當濾波器為1100 LP時，后肢血管的FWHM為643 μm，而當濾波器為1300 LP時，后肢血管的FWHM為495 μm(圖3C和D)。此外，當濾波器為1300 LP時，SBR為2.57，顯著高于濾波器為1100 LP時的1.53。隨后，在與腿部血管相似的條件下對裸鼠的腦血管進行成像(圖3E和F)。如圖3G和H所示，F(xiàn)WHM分別為936 μm (1100 LP)和608 μm (1300 LP)。SBR分別為1.42 (1100 LP)和2.43 (1300 LP)。TPGS-NT-4 NPs在注射后24 h左右被完全代謝。注射TPGS-NT-4 NPs后24 h，對裸鼠(n = 3)進行安樂死和解剖，H&E染色分析不同臟器。H&E染色分析實驗顯示，經尾靜脈注射TPGS-NT-4 NPs對裸鼠各臟器無明顯損傷，證明TPGS-NT-4 NPs在體內具有良好的生物相容性。綜上所述，所有實驗結果表明，TPGS-NT-4 NPs可以作為NIR-II窗口體內血管成像的理想候選。

Figure 3

 

4）TPGS-NT-4 NPs光熱性質研究

雖然NIR-II成像可以增加成像深度，但探針在NIR-II窗口內的QYs仍然較低。根據(jù)雅布隆斯基圖理論，NIR-II探針返回基態(tài)所吸收的能量大部分以非輻射形式釋放。本文研究了TPGS-NT-4 NPs的光熱性質。在808 nm激光照射下，TPGS-NT-4 NPs的溫度變化(ΔT)隨著激光功率的增強而增大(圖4A)。當激光功率密度為0.6 W/cm2時，溫度變化可達33.2℃。同時，納米顆粒的ΔT也隨著濃度的增加呈增加趨勢(圖4B)。為了證明光熱效應是由包封藥物引起的，還研究了空殼納米粒子(TPGS NPs)。如圖4C所示，TPGS- NT -4 NPs的光熱效應明顯高于水和TPGS NPs。這些結果證明了NT-4包封探針產生的增溫效應。同時，在相同光照條件下，NT-4在DMSO中的光熱性質與TPGS-NT-4相似。NT-4的光熱轉化率為43%。紅外熱成像圖像進一步證實了TPGS-NT-4 NPs良好的光熱性能，如圖4E所示。最后，對TPGS-NT-4 NPs的光熱穩(wěn)定性進行了監(jiān)測。如圖4D所示，TPGS-NT-4 NPs在90 min (808 nm, 0.6 W/cm2)內經歷了三個光開關周期，而最高溫度沒有明顯變化。計算TPGS-NT-4 NPs的光熱轉化率為45%。對比已報道的光熱劑，TPGS-NT-4 NPs對NIR-II成像的光熱轉化率處于中上區(qū)間。由此可見，TPGS-NT-4 NPs具有優(yōu)異的光熱性能，有望開發(fā)為光熱治療劑。

Figure 4

 

5）TPGS-NT-4 NPs光熱處理效果的體內評價

建立4T1腫瘤小鼠模型，來評價TPGS-NT-4 NPs作為光熱劑的治療作用。腫瘤生長后，將實驗小鼠隨機分為4組:對照組、PBS加激光組、TPGS加激光組、TPGS- NT -4 NPs加激光組(n = 3)。本文設計了一種局部光熱治療聯(lián)合血管造影的方法，旨在提高TPGS-NT-4 NPs的腫瘤攝取，同時最大限度地減少對正常組織的損傷。本動物實驗流程如圖5A所示。首先，局部注射TPGS-NT-4 NPs (30 μL, 0.1 mg/mL)至腫瘤附近血管。注射后10分鐘，在近紅外二區(qū)對小鼠局部血管進行成像。如圖5A所示，局部注射部位(紅圈標記)血管亮度顯著，腫瘤(藍圈標記)也呈現(xiàn)熒光。這些結果表明，TPGS-NT-4 NPs通過血管向腫瘤方向積累。然后對小鼠進行光熱治療(PTT)，獲得小鼠的紅外熱像圖(圖5B)，注射TPGS-NT-4 NPs并進行808 nm激光照射的小鼠，腫瘤區(qū)域溫度明顯升高，照射10 min后達到54.7°C的峰值，而注射納米殼或水的小鼠未觀察到明顯的加熱。隨后，對4T1腫瘤小鼠進行10分鐘的激光照射。然后每2 d記錄不同治療組小鼠的體重和腫瘤大小，連續(xù)14 d。與對照組、激光照射PBS和激光照射TPGS相比，注射TPGS- NT -4 NPs小鼠的腫瘤明顯縮小(圖5C)。為了觀察治療后腫瘤的差異，不同治療組的小鼠在治療周期結束時被安樂死并解剖。圖5E顯示，經TPGS-NT-4 NPs治療后，腫瘤明顯縮小甚至消失。同時，在治療期間，相應組小鼠的體重沒有顯著差異(圖5D)。不同組腫瘤的TUNNEL染色分析也顯示，激光照射后TPGS-NT-4 NPs在組織水平上具有腫瘤殺傷作用(圖5F)。這些結果表明TPGS-NT-4 NPs具有出色的光熱處理效果。

Figure 5

 

結論：本文報道了一系列具有不對稱D-A結構的新型NIR-II探針(NT-1, NT-2, NT-3和NT-4)。利用噻吩結構作為π橋合成了NT-1探針�；�于用EDOT代替噻吩的屏蔽策略設計了NT-2。由于EDOT能夠扭曲主鏈的偶聯(lián)以及阻止分子間和分子內的相互作用，NT-2的QY顯著增加，約為NT-1的1.8倍。進一步擴展NT-1和NT-2，得到了發(fā)射波長紅移的探針(NT-3和NT-4)。結果表明，NT-1、NT-2、NT-3和NT-4具有高QY和大Stokes位移等優(yōu)異的光學性能。此外，與報道的NIR-II探針相比，這四種探針的另一個優(yōu)點是合成過程簡單，產率高達90%左右。隨后，本研究選擇NT-4進行修飾和制備納米顆粒(TPGS-NT-4 NPs)。體內血管造影實驗顯示TPGS-NT-4 NPs在1300 LP下具有較高的分辨率和SBR，證明TPGS-NT-4 NPs具有高分辨率的NIR-II成像引導血管造影的能力。NT-1、NT-2、NT-3和NT-4不僅擴展了不對稱NIR-II探針的文庫，而且其簡單的合成和顯著的NIR-II成像特性也有利于它們的商業(yè)或臨床轉化。此外，TPGS-NT-4 NPs具有良好的光熱性能。基于局部遞送和治療的優(yōu)勢，在808 nm激光照射下局部注射TPGS-NT-4 NPs并血管造影后，腫瘤縮小甚至消融。局部光熱療法聯(lián)合血管造影可以進一步增加腫瘤攝取，同時減少對正常組織的損傷。這些實驗結果進一步表明，TPGS-NT-4 NPs有望成為血管造影和局部光熱成像的有效藥物。

 

參考文獻

Li, L., Ma, X., Peng, Y., Yin, J., Guissi, N. E. I., & Wang, Y. (2023). Bright Asymmetric Shielding Strategy-Based NIR-II Probes for Angiography and Localized Photothermal Therapy. ACS Appl Bio Mater, 6(4), 1639-1649. 

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評為“國家高新技術企業(yè)”，上海市“科技創(chuàng)新行動計劃”科學儀器領域立項單位。

          恒光智影，致力于為生物醫(yī)學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供先進的、一體化的成像解決方案。

          與基于可見光/近紅外一區(qū)的傳統(tǒng)熒光成像技術相比，我們的技術側重于近紅外二區(qū)范圍并整合CT, X-ray，超聲，光聲成像技術。

          可為腫瘤藥理、神經藥理、心血管藥理、大分子藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫(yī)藥與科學儀器服務。