本文要點(diǎn)：阿爾茨海默病(AD)是臨床最廣泛的神經(jīng)退行性疾病，嚴(yán)重威脅人們的生命健康。β 淀粉樣蛋白 (Aβ) 作為AD的典型病理生理學(xué)標(biāo)志物，來(lái)源于單體 Aβ 自發(fā)聚集成形成不溶性Aβ原纖維，積聚并沉積在大腦中，從而誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)性疾病。目前還沒(méi)有有效的策略來(lái)治療AD的發(fā)生發(fā)展。腦脊液的診斷過(guò)程具有侵入性（脊髓穿刺），因此不被廣泛接受。相比之下，開發(fā)用于檢測(cè)Aβ蛋白的成像探針為AD的早期表征和及時(shí)干預(yù)提供了有效策略，如正電子發(fā)射斷層掃描（PET）、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（SPECT）和磁共振成像（MRI）等。然而這些探針具有靈敏度低、成本高、電離輻射和高背景等缺點(diǎn)，因此開發(fā)可激活熒光探針具有重要意義。

 

---

目前，用于Aβ蛋白的成像熒光探針有硫黃素T（ThT）和硫黃素S（ThS），但他們的發(fā)射波長(zhǎng)短（480 nm），血腦屏障（BBB）穿透能力差，限制了它們的體內(nèi)應(yīng)用。此外，雖然有一些可激活的熒光探針用于Aβ蛋白的體內(nèi)成像，但這些探針的熒光發(fā)射通常位于NIR-I區(qū)(650–900 nm) ，穿透深度淺，信噪比(SNR)低，不適合腦組織成像。因此本文作者開發(fā)了NIR-II區(qū)（900–1700 nm）發(fā)射的可激活熒光探針用于Aβ蛋白的體內(nèi)成像(圖1)。

 

圖1. DMP2用于Aβ蛋白的體內(nèi)成像

 

首先，作者設(shè)計(jì)并篩選了一系列Aβ蛋白的特異性NIR-II熒光響應(yīng)探針(D-π-A結(jié)構(gòu))，探針由三部分組成：咔唑或二甲氨基苯為電子供體（D），噻吩橋或雙鍵為π橋，同時(shí)提高親脂性（容易透過(guò)BBB），以及苯并吲哚鎓作為電子受體（A），合成了熒光探針ECV、DMP1、DMP2和DMP3（圖2a）。隨后，作者評(píng)價(jià)了探針的光學(xué)性能。溶劑效應(yīng)測(cè)試說(shuō)明ECV發(fā)射位于NIR-I區(qū)，其他三種化合物均處于NIR-II區(qū)（圖2e-h）。Gaussian09W計(jì)算進(jìn)一步說(shuō)明更強(qiáng)的給電子作用能夠增強(qiáng)推拉效應(yīng)，從而產(chǎn)生NIR-II區(qū)的紅移熒光（圖2i）。

圖2. (a) 探針的分子結(jié)構(gòu) (e、f、g、h) ECV、DMP1、DMP2和DMP3探針在不同極性溶劑中的熒光光譜。(i) 探針在水中的HOMO-LUMO能極差。

 

此外，作者還觀察到這四種探針對(duì)粘度有依賴性的熒光變化，所以推斷探針可能發(fā)生了扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過(guò)程(Twisted Intramolecular Charge Transfer, TICT)。TICT效應(yīng)已被用于檢測(cè)A β蛋白的熒光探針的構(gòu)建，抑制分子內(nèi)的TICT效應(yīng)能夠提高熒光探針的穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率。緊接著，作者測(cè)試并篩選了探針對(duì)Aβ原纖維的響應(yīng)情況。與Aβ原纖維孵育后，DMP1、DMP2和DMP3的NIR-II熒光分別選擇性的增強(qiáng)了27.0倍、41.8倍和43.1倍，而ECV幾乎無(wú)差異（圖3f-h）。熒光增強(qiáng)可能是由于Aβ原纖維介導(dǎo)了探針在光照射情況下從非發(fā)射扭曲的TICT狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦邿晒鉁?zhǔn)平面局部激發(fā)(LE)狀態(tài)。相比于商業(yè)探針ThT僅5.1倍的熒光增強(qiáng)，DMP2和DMP3具有更理想的成像對(duì)比度。基于熒光的飽和結(jié)合法計(jì)算DMP2的結(jié)合親和力(Kd)為42.0 nM，與Aβ原纖維具有最佳的結(jié)合親和力（圖3i-k）。然后作者使用DMP2測(cè)試其與ThT結(jié)合的Aβ原纖維的競(jìng)爭(zhēng)位移能力，置換率高達(dá)72%(圖3l)。

圖3. (e) 探針與Aβ聚集體結(jié)合后的熒光增強(qiáng)倍數(shù) (f、j、h) 探針在其他潛在干擾物存在時(shí)對(duì)Aβ聚集體的選擇性研究(1-10：潛在干擾物，離子、氨基酸和牛血清白蛋白等11：Aβ 單體) (i、j、k) PBS溶液中探針的結(jié)合親和力測(cè)定 (l) DMP2和ThT探針的競(jìng)爭(zhēng)置換實(shí)驗(yàn)。

 

然后，作者使用分子對(duì)接軟件模擬了探針與Aβ原纖維之間的相互作用(圖4)，進(jìn)一步說(shuō)明了DMP2探針具有高選擇性的熒光“off-on”響應(yīng)和與Aβ蛋白的強(qiáng)結(jié)合親和力，在檢測(cè)Aβ蛋白方面具有很大前景。

圖4. DMP2與Aβ原纖維的相互作用圖

 

隨后，作者檢測(cè)了DMP2與Aβ蛋白結(jié)合后NIR-II熒光的穿透深度。NIR-II熒光在0.5 cm厚度下的信噪比仍然為20.4，在1.5 cm的厚度上，NIR-II熒光信號(hào)仍是可識(shí)別的(圖5a-b)。與此同時(shí)，作者通過(guò)構(gòu)建體外血腦屏障模型（圖5c）測(cè)試了DMP2穿透血腦屏障的能力。DMP2的通透性隨孵育時(shí)間的增加而增加，120 min后達(dá)到23.8%，比ThT高9.9倍，與FDA批準(zhǔn)的可穿透血腦屏障的藥物替莫唑胺(TMZ)相當(dāng)，說(shuō)明其其親脂性適合穿透血腦屏障(圖5d)。

圖5. (a、b) DMP2探針在溶液和腦切片中的組織滲透能力研究 (c、d) 體外血腦屏障模型及Transwell室滲透性試驗(yàn)

 

在活體測(cè)試中作者選用探針DMP2與商業(yè)探針ThS分別對(duì)野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的腦組織切片進(jìn)行成像對(duì)比，正如預(yù)期的，在DMP2或ThS染色后，在野生型小鼠腦切片中沒(méi)有觀察到明顯的熒光。相比之下，在用ThS和DMP2染色后，來(lái)自AD模型小鼠的腦切片在大腦皮層和海馬區(qū)域顯示出聚集性熒光，表明DMP2對(duì)Aβ蛋白的檢測(cè)具有高度特異性。此外，對(duì)腦切片中線性靶向區(qū)域熒光強(qiáng)度的定量研究進(jìn)一步說(shuō)明了DMP2和ThS均可染色Aβ蛋白，但前者的信號(hào)更強(qiáng)（圖5 e-f）。

圖5 (e、f)野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的腦組織切片成像

 

最后在體內(nèi)成像時(shí)，作者選用8月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠和野生型小鼠進(jìn)行研究（圖6a）。野生型小鼠在注射DMP2后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦內(nèi)熒光信號(hào)均較弱。而AD模型小鼠僅注射后10分鐘就觀察到了明顯的NIR-II熒光信號(hào)，且能在腦內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間保留，可用于體內(nèi)實(shí)時(shí)縱向成像（圖6b）。隨后作者處死小鼠提取腦組織，記錄NIR-II熒光成像，進(jìn)一步證實(shí)NIR-II熒光來(lái)源于AD小鼠腦組織。同時(shí)，共聚焦成像顯示的皮層和海馬部位明顯的熒光信號(hào)說(shuō)明DMP2可以高效高特異性的識(shí)別AD模型小鼠的Aβ蛋白，可用于Aβ蛋白的無(wú)創(chuàng)成像，深入了解疾病的發(fā)生發(fā)展（圖6f）。

圖6 (a) DMP2探針的NIR-II熒光成像示意圖 (b)野生型小鼠和AD模型小鼠的活體腦成像 (f) Aβ單克隆抗體(MOAB)染色后的腦組織切片離體熒光圖像

 

參考文獻(xiàn)

Miao, J., Miao, M., Jiang, Y., Zhao, M., Li, Q., Zhang, Y., et al. (2023). An Activatable NIR-II Fluorescent Reporter for In Vivo Imaging of Amyloid-beta Plaques. Angew Chem Int Ed Engl, 62(7), e202216351.

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評(píng)為“國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)”，上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”科學(xué)儀器領(lǐng)域立項(xiàng)單位。

          恒光智影，致力于為生物醫(yī)學(xué)、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供先進(jìn)的、一體化的成像解決方案。

          與基于可見(jiàn)光/近紅外一區(qū)的傳統(tǒng)熒光成像技術(shù)相比，我們的技術(shù)側(cè)重于近紅外二區(qū)范圍并整合CT, X-ray，超聲，光聲成像技術(shù)。

          可為腫瘤藥理、神經(jīng)藥理、心血管藥理、大分子藥代動(dòng)力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫(yī)藥與科學(xué)儀器服務(wù)。