剪切應(yīng)力通過上調(diào)細(xì)胞表面熱休克蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)炎癥

瀏覽次數(shù)：1005　發(fā)布日期：2023-5-11　來源：泉眾

動(dòng)脈粥樣硬化是一種動(dòng)脈慢性炎癥性疾病，其特征是脂質(zhì)成分和巨噬細(xì)胞堆積形成斑塊，其中這些細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。沿血流循環(huán)的單核細(xì)胞被募集到動(dòng)脈壁，其運(yùn)動(dòng)受趨化因子c-c基序趨化因子配體2（CCL2）的調(diào)控，單核細(xì)胞暴露于剪切應(yīng)力有助于它們更容易穿透內(nèi)皮。遷移后，單核細(xì)胞分化成活化的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的激活在傷口愈合的組織修復(fù)和再生中起著重要作用，而活化至M1表型的巨噬細(xì)胞會(huì)分泌大量促炎細(xì)胞因子，如CCL2、IL-1β和TNF-α。因此，巨噬細(xì)胞的激活促進(jìn)周圍微環(huán)境調(diào)控的促炎或抗炎作用。巨噬細(xì)胞通常位于斑塊破裂部位，可能受到機(jī)械刺激。然而，巨噬細(xì)胞在承受機(jī)械應(yīng)力時(shí)的功能是未知的。

血流動(dòng)力學(xué)剪切應(yīng)力是一種機(jī)械因素，被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的主要因素。為了更好地了解生物力學(xué)刺激對(duì)炎癥的影響，韓國國立釜山大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系、韓國生命工學(xué)研究院、嶺南大學(xué)藥學(xué)系聯(lián)合團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究將人THP-1單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞暴露于剪切應(yīng)力下，并檢測炎癥分子的表達(dá)。這項(xiàng)研究中報(bào)告了新的結(jié)果，表明生物力學(xué)刺激是激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞為促炎表型的因素之一，還確定了被認(rèn)為與剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)的膜蛋白。此外，使用人和小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊標(biāo)本研究了已識(shí)別的一種蛋白的表達(dá)，以驗(yàn)證結(jié)果的體內(nèi)相關(guān)性。

剪切應(yīng)力誘導(dǎo)促炎 M1 標(biāo)志物的產(chǎn)生

為了研究剪切應(yīng)力是否影響單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的表型，實(shí)驗(yàn)利用THP-1細(xì)胞確定了剪切應(yīng)力對(duì)M1/ M2標(biāo)志物的時(shí)間過程影響。RT-PCR顯示CCL2、IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平在暴露于剪切應(yīng)力（SS，12 dynes/cm2）12小時(shí)后開始增強(qiáng)，并在24小時(shí)變得明顯（圖1 A）。相比之下，在暴露于剪切應(yīng)力24小時(shí)后，M2標(biāo)記物CD163和LXRα的轉(zhuǎn)錄水平降低。這些結(jié)果表明，剪切應(yīng)力誘導(dǎo)促炎M1標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄。

然后通過ELISA測定了CCL2，TNF-α和IL-1β的分泌水平（圖1 B）。剪切應(yīng)力暴露12和24小時(shí)后，CCL2分泌增加。THP-1細(xì)胞分泌少量或幾乎檢測不到的TNF-α和IL-1β，但剪切應(yīng)力應(yīng)用12和24小時(shí)后，TNF-α 和 IL-1β分泌增加。這些結(jié)果表明，剪切應(yīng)力增強(qiáng)了促炎分子的分泌。

這些數(shù)據(jù)表明，剪切應(yīng)力在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上增加了多個(gè)M1標(biāo)記分子的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表達(dá)，極化為促炎表型。

圖1 剪切應(yīng)力對(duì)M1極化標(biāo)記物的影響。

剪切應(yīng)力對(duì)CCL2、TNF-α和IL-1β的表達(dá)是可逆的

接下來研究了M1標(biāo)志物的表達(dá)是否受到剪切應(yīng)力消失的影響（圖1 C、D）。剪切應(yīng)力處理24小時(shí)后，CCL2，TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平增加，但在無剪切應(yīng)力的正常培養(yǎng)條件下再培養(yǎng)24 小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（圖1 C）。實(shí)驗(yàn)還測量了這些標(biāo)志物的分泌。將剪切應(yīng)力刺激的細(xì)胞分為兩組：在沒有剪切應(yīng)力暴露的情況下再培養(yǎng)24小時(shí)，沒有（ST）和有改變培養(yǎng)基（mc ST）（圖1 D）。CCL2和TNF-α的分泌在剪切應(yīng)力下增加，當(dāng)細(xì)胞恢復(fù)到正常培養(yǎng)條件而沒有改變培養(yǎng)基時(shí)繼續(xù)分泌。CCL2分泌進(jìn)一步增強(qiáng)。然而，當(dāng)剪切應(yīng)力細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下且改變培養(yǎng)基時(shí)，CCL2、TNF-α和IL-1β的分泌顯著減少或降低到基礎(chǔ)水平。這些結(jié)果表明，由剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的炎癥分子的表達(dá)在剪切應(yīng)力刺激細(xì)胞中是可逆的。

ERK 和 Src 通路抑制劑可抑制剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 M1 標(biāo)志物表達(dá)

由于SRC和ERK信號(hào)參與巨噬細(xì)胞極化為促炎表型，實(shí)驗(yàn)使用MEK抑制劑U0126評(píng)估了它們?cè)诩羟袘?yīng)力誘導(dǎo)的M1標(biāo)志物表達(dá)中的作用，該抑制劑可激活ERK1/2和SRC激酶抑制劑PP2（圖1 E）。暴露于剪切應(yīng)力的THP-1細(xì)胞中CCL2的轉(zhuǎn)錄水平增加。然而，在U0126和PP2存在的情況下，這種增加開始降低。IL-1β轉(zhuǎn)錄水平也以類似于CCL2的模式下降，而TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有通過兩種抑制劑的處理而改變。在剪切應(yīng)力下，這些結(jié)果表明，ERK和SRC信號(hào)通路參與巨噬細(xì)胞CCL2和IL-1β的表達(dá)，而不是TNF-α的表達(dá)。

剪切應(yīng)力上調(diào)表層蛋白（包括 HSPs）的表達(dá)

接下來實(shí)驗(yàn)研究了剪切應(yīng)力是否改變了細(xì)胞表層的蛋白質(zhì)水平。從THP-1細(xì)胞中分離細(xì)胞表層蛋白（圖2 A），然后研究了剪切應(yīng)力是否會(huì)影響熱休克蛋白105、熱休克蛋白90、熱休克蛋白70（ HSP105，HSP90，HSP70）和人腺苷酸環(huán)化酶關(guān)聯(lián)蛋白1（ CAP1）的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平。HSP105和CAP1的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有變化，而HSP90和HSP70的轉(zhuǎn)錄水平增加（圖2 B）。然后分析蛋白質(zhì)表達(dá)（圖2 C），HSP105，HSP90和HSP70的細(xì)胞水平與對(duì)照組（0 h SS）相比增加。然后測定它們?cè)谀ど系乃剑▓D2 D），剪切應(yīng)力24h后，THP-1細(xì)胞表層蛋白水平上調(diào)。在上述蛋白質(zhì)中，CAP1的表達(dá)增加最低。

流式細(xì)胞術(shù)測定的暴露于剪切應(yīng)力后，HSP105、HSP90 和 HSP70 的水平在 THP-1 細(xì)胞表面上調(diào)（圖2 E）。當(dāng)用共聚焦顯微鏡觀察免疫染色的THP-1細(xì)胞時(shí)，觀察到該蛋白質(zhì)的表面表達(dá)增加（圖2 F）。這些數(shù)據(jù)表明，剪切應(yīng)力上調(diào)了單核細(xì)胞中HSP105，HSP90和HSP70的細(xì)胞內(nèi)和表面水平。

圖2 剪切應(yīng)力對(duì)表層蛋白的影響。

抑制HSPs 可抑制剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的炎癥標(biāo)志物表達(dá)

實(shí)驗(yàn)研究了HSPs是否參與剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的炎癥分子的表達(dá)。首先，使用兩種抑制劑17-DMAG和STA-9090檢查HSP90的參與。CCL2、TNF-α和IL-1β基因的轉(zhuǎn)錄水平在暴露于剪切應(yīng)力后增加，并且在17-DMAG或STA-9090存在下顯著被抑制。在17-DMAG或STA-9090存在下，剪切應(yīng)力增強(qiáng)的CCL2，TNF-α和IL-1β的分泌被阻斷。這些結(jié)果表明，HSP90的藥理學(xué)抑制導(dǎo)致炎癥反應(yīng)減少。

此外還利用VER155008和knk437研究了HSP70和HSP105是否參與了促炎表型的極化。VER155008是HSP70家族的有效抑制劑，而knk437抑制多種HSPs，包括HSP105和HSP70。在VER155008和knk437存在下，剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的CCL2，TNF-α和IL-1β基因的轉(zhuǎn)錄水平受損，CCL2，TNF-α和IL-1β的分泌也受到顯著抑制。其中，knk437有效抑制炎癥分子的表達(dá)。這些結(jié)果表明，HSP105和HSP70抑制劑降低了炎癥分子的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)觀察到剪切應(yīng)力后CCL2分泌增加。于是研究了分泌的CCL2是否具有功能，因?yàn)镃CL2是單核細(xì)胞的有效趨化因子。剪切應(yīng)力24小時(shí)后的THP-1細(xì)胞上清液中含有高水平的CCL2，增加了單核細(xì)胞的遷移。在剪切應(yīng)力暴露后獲得的上清液中，細(xì)胞遷移增強(qiáng)，而當(dāng)細(xì)胞暴露于在HSP90、HSP70和HSP105抑制劑存在下的上清液時(shí)，細(xì)胞遷移降低，與CCL2分泌的結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，HSP90、HSP70和HSP105影響剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞遷移�？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，剪切應(yīng)力后HSPs上調(diào)參與剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

CD68 和 HSP90 在 ApoE-缺陷小鼠和人股動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化病變中共存與共定位

最后實(shí)驗(yàn)研究了HSP90在發(fā)生血流紊亂的動(dòng)脈粥樣硬化病變中的巨噬細(xì)胞表達(dá)。ApoE-缺陷小鼠出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化病變（圖3 A）。HSP90和CD68（泛巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）免疫反應(yīng)性在ApoE-缺陷小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變中檢測到，但在野生型小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變中未檢測到（圖3 A）。

為了研究HSP90和CD68的共定位，使用了人類標(biāo)本。在股動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的肩部區(qū)域檢測到CD68和HSP90的免疫反應(yīng)性（圖3 B）。當(dāng)兩個(gè)圖像合并時(shí)，觀察到兩個(gè)分子的廣泛共定位。一些CD68/HSP90陽性細(xì)胞位于血管內(nèi)壁的管腔側(cè)或下方，細(xì)胞容易受到剪切應(yīng)力（a）。然而，在沒有剪切應(yīng)力的巨噬細(xì)胞缺失的區(qū)域沒有檢測到HSP90表達(dá)（b）。這些數(shù)據(jù)表明，體內(nèi)巨噬細(xì)胞HSP90的表達(dá)在剪切應(yīng)力條件下增加。

圖3 免疫組織化學(xué)（IHC）分析小鼠和人源性動(dòng)脈粥樣硬化病變中CD68和HSP90的表達(dá)。

圖4 暴露于血流的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥示意圖。

駐留在受損動(dòng)脈剝落區(qū)域的巨噬細(xì)胞受到剪切應(yīng)力并分泌炎性細(xì)胞因子，包括CCL2，TNF-α和IL-1β。分泌的CCL2促進(jìn)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的募集到該區(qū)域，從而增加免疫細(xì)胞的數(shù)量。受剪切應(yīng)力影響的巨噬細(xì)胞也會(huì)增加HSPs的表層表達(dá)，例如HSP105，HSP90和HSP70，這是產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和趨化因子所必需的。剪切應(yīng)力通過表層蛋白的上調(diào)參與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。

總之，這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，剪切應(yīng)力激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，使它們上調(diào)炎癥分子的表達(dá)和HSPs的細(xì)胞表層水平，如HSP70，HSP90和HSP105，這可能是主動(dòng)脈血管內(nèi)皮剝脫后血管炎癥的治療靶點(diǎn)。未來需要進(jìn)一步研究HSPs在體內(nèi)血管重塑中的作用，并了解機(jī)械刺激下炎癥分子和HSPs表達(dá)的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Son H, Choi HS, Baek SE, Kim YH, Hur J, Han JH, Moon JH, Lee GS, Park SG, Woo CH, Eo SK, Yoon S, Kim BS, Lee D, Kim K. Shear stress induces monocyte/macrophage-mediated inflammation by upregulating cell-surface expression of heat shock proteins. Biomed Pharmacother. 2023 May;161:114566. doi: 10.1016/j.biopha.2023.114566. Epub 2023 Mar 22. PMID: 36963359.

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剪切應(yīng)力通過上調(diào)細(xì)胞表面熱休克蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)炎癥