文獻(xiàn)解讀：非病變性狼瘡皮膚有助于骨髓細(xì)胞炎癥進(jìn)展并引發(fā)皮膚炎癥
影響因子：19.319
導(dǎo)語
皮膚紅斑狼瘡（cutaneous lupus erythematosus，CLE）是一種導(dǎo)致患者毀容且認(rèn)知甚少的疾病，CLE常與系統(tǒng)性狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）有所關(guān)聯(lián)。過去的研究表明，非損傷性角化細(xì)胞在疾病易感性中發(fā)揮作用，但目前尚沒有以全面的方式或在其他細(xì)胞群作用的背景下進(jìn)行研究。
科學(xué)問題
目前CLE患者皮膚中不同細(xì)胞類型的功能作用、細(xì)胞群間異常的細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)、炎癥誘因的細(xì)胞介質(zhì)尚未得到很好的定義。
研究技術(shù)
10×單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq），10×空間轉(zhuǎn)錄組，質(zhì)譜流式，免疫組化。
方法
7名CLE患者的皮膚組織，分別選取“損傷病灶部分”和“非病灶皮膚組織”（防曬處理），該7名患者中有6名伴有SLE；同時(shí)選取14名健康對(duì)照的皮膚組織，一共28個(gè)組織樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；同時(shí)還選取7名患者和4名健康對(duì)照的PBMC樣本，一共11個(gè)細(xì)胞樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究細(xì)胞群的轉(zhuǎn)變。盤狀狼瘡病變（discoid lupus erythematosus，DLE）皮膚切片，設(shè)計(jì)生物學(xué)重復(fù)4例，進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
結(jié)論
本文證明，紅斑狼瘡患者的正常皮膚中富集I型干擾素相關(guān)的表達(dá)模式，作為病變前環(huán)境，其主要的皮膚細(xì)胞類型基因表達(dá)異常，并且預(yù)測(cè)的細(xì)胞-細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)也出現(xiàn)紊亂。本文還表明，紅斑狼瘡富集 CD16+ 樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC），DC在皮膚中受到強(qiáng)力的干擾素調(diào)控，從而獲得促炎表型�？傊疚牡臄�(shù)據(jù)提供了紅斑狼瘡病變和非病變皮膚的全面特征，并提示 CD16+ DC在CLE發(fā)病機(jī)制中的作用。
研究思路
研究結(jié)果
1. CLE患者的皮損病灶和非皮損皮膚組織進(jìn)行scRNA-seq發(fā)現(xiàn)皮膚細(xì)胞群和免疫細(xì)胞群占比差異
一共28個(gè)樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，最終捕獲檢測(cè)46,540個(gè)細(xì)胞，平均基因數(shù)為2,618 個(gè)/細(xì)胞，平均轉(zhuǎn)錄本數(shù)為11,645個(gè)/細(xì)胞，分組包括：皮損病灶（lesional，L）、非皮損皮膚組織（nonlesional，N）和健康對(duì)照皮膚（healthy，H）。一共注釋10種主要細(xì)胞類型，包括角質(zhì)化細(xì)胞（keratinocytes，KCs）和髓系細(xì)胞，都顯著在CLE患者皮膚中的聚集。細(xì)胞組成分析顯示，與H組對(duì)比，L組和N組中髓系細(xì)胞的比例都有所增加。
2. CLE患者的皮損病灶和非皮損皮膚組織的KCs均表現(xiàn)出病理性I型干擾素的特征
對(duì)特征性KC亞型標(biāo)記物的分析確定了五種KC狀態(tài)：基底狀，棘突狀，棘上狀，卵泡狀，循環(huán)狀。狼瘡患者主要對(duì)應(yīng)基底態(tài)和棘上狀的亞群。本文通過單細(xì)胞的數(shù)據(jù)計(jì)算亞群細(xì)胞因子模塊得分，并通過小提琴圖展示。結(jié)果顯示狼瘡患者富集細(xì)胞群為基底狀（亞簇8）和棘突狀（亞簇5和6），該亞群由IFN-α高得分的KCs為主體，然而IFN-γ和TNF區(qū)別并沒有那么顯著。對(duì)比L組和H組KC基底狀的亞群的差異基因，并根據(jù)差異基因富集，結(jié)果顯示在L組中富集IFN信號(hào)通路。
3. scRNA-seq發(fā)現(xiàn)在CLE患者中富集的成纖維細(xì)胞亞型且該細(xì)胞群表現(xiàn)出強(qiáng)烈的干擾素反應(yīng)特征
基于分組對(duì)比，發(fā)現(xiàn)只有成纖維細(xì)胞（fibroblast，F(xiàn)B）中的亞簇4在狼瘡患者中占主體。根據(jù)已報(bào)道的皮膚FB標(biāo)記基因，對(duì)成纖維細(xì)胞亞簇進(jìn)行歸類注釋，分別為：分泌型卷曲相關(guān)蛋白2 （SFRP2）+ 、XI膠原型α1鏈 （COL11A1）+ 、分泌型卷曲相關(guān)蛋白4 （SFRP4）+ FB，除此外還有高表達(dá) COL26A1 和RAMP1（受體活性修飾蛋白，（RAMP1）+ FBs）的細(xì)胞群。同樣針對(duì)FBs亞群其細(xì)胞因子模式進(jìn)行分析，并通過小提琴圖展示，結(jié)果顯示IFN-FBs中特異性表達(dá)IFN-α和IFN-γ，且這種顯著的干擾素基因改變僅在CLE患者皮膚特定的亞簇中出現(xiàn)。
4. CLE患者的皮損病灶和非皮損皮膚組織中浸潤的T細(xì)胞包括調(diào)節(jié)T細(xì)胞等亞群均受到干擾素的調(diào)控
基于亞簇聚類和標(biāo)記基因的注釋定義了9個(gè)T細(xì)胞亞組。通過對(duì)比N組和H組的調(diào)節(jié)T細(xì)胞的基因表達(dá)差異，確定了許多ISG（干擾素刺激基因，IFN-stimulated gene），表明在N組中調(diào)節(jié)T細(xì)胞呈現(xiàn)慢性IFN刺激特征。該特征可能會(huì)導(dǎo)致調(diào)節(jié)T細(xì)胞在狼瘡患者中維持免疫穩(wěn)態(tài)的能力和自我耐受的能力受損。此外，經(jīng)過低劑量IL-2治療后，調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能和疾病活性都得到改善，該結(jié)果進(jìn)一步支持IFN介導(dǎo)的調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能紊亂對(duì)紅斑狼瘡致病起到作用�？偠灾琓細(xì)胞比例失衡、IFN-T細(xì)胞和IFN誘導(dǎo)形成T細(xì)胞亞群的存在，這些證據(jù)均表明CLE紅斑狼瘡患者的非病灶皮膚（N組）在病變前環(huán)境中已存在異常T細(xì)胞浸潤。
5. CLE患者的皮損病灶和非皮損皮膚組織中髓系細(xì)胞亞群的主要變化
本文還評(píng)估了髓系細(xì)胞，作為皮膚中另一種主要的免疫細(xì)胞。通過亞簇聚類和注釋，鑒定了9個(gè)具有顯著不同標(biāo)記基因的髓系細(xì)胞亞群。健康對(duì)照皮膚和狼瘡患者皮膚進(jìn)行對(duì)比，CD16+ DCs是差異顯著的細(xì)胞群之一。與健康皮膚相比，CLE患者的非皮損組織和皮損病灶組織中CD16+ DC豐度占比更顯著。在健康對(duì)照皮膚中（H組），cDC2Bs占髓系細(xì)胞的近一半（47%）；這與CLE患者非皮損組織有很大不同，N組中pDCs占主導(dǎo)地位（41%）。相對(duì)于cDC2Bs，CD16+ DC在Toll樣受體刺激下也表現(xiàn)出分泌炎性細(xì)胞因子的能力增強(qiáng)。因此，狼瘡患者D16+ DC的擴(kuò)增和功能增強(qiáng)可能促進(jìn)發(fā)病機(jī)制。
6. 配體-受體分析顯示紅斑狼瘡患者中預(yù)測(cè)細(xì)胞相互作用主要涉及 CD16+ DC
在鑒定了細(xì)胞群體后，本文使用了CellPhoneDB分析性患者皮膚中細(xì)胞間通訊。所有組織包括：健康對(duì)照（H組），非皮損組織（N組）和皮損病灶（L組）均進(jìn)行了配體受體討論。在H組中，有比較少的配受體對(duì)，其中最強(qiáng)的是KCs-KCs配受體對(duì)。相比之下，N組表現(xiàn)出更多的相互作用，F(xiàn)Bs是主要的配體表達(dá)細(xì)胞類型，髓系細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，EC）也具有高度的相互作用。L組中髓系細(xì)胞和EC在相互作用中最為突出。
初步結(jié)果可發(fā)現(xiàn)N組中有比較密集的相互作用，因此選取N組構(gòu)建了網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步分析。KCs基底狀亞群表達(dá)的配體和內(nèi)皮細(xì)胞受體關(guān)聯(lián)，這表明KCs可能涉及免疫細(xì)胞浸潤組織的機(jī)制。IFN-FBs是所有細(xì)胞亞群中活性最高的。然而，無論是配體還是受體CD16+ DC都有最多的配受體對(duì)，CD16+ DC顯示富集出很多的相互作用，涉及IFN-FBs、Tph/Tfh細(xì)胞和cDC2B細(xì)胞。pDCs相對(duì)惰性，很少參與L-R對(duì)，這與最近文獻(xiàn)報(bào)道稱SLE皮膚中pDCs衰老表型的結(jié)論一致。
7. 空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和scRNA-seq整合分析提供在患者皮膚中細(xì)胞互作的的空間架構(gòu)
本文通過空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)到632個(gè)spots（檢測(cè)位點(diǎn)），每個(gè)spot平均檢測(cè)出3704個(gè)基因和10176個(gè)轉(zhuǎn)錄本。大多數(shù)在表皮下和毛囊周圍區(qū)域spots具有高的免疫細(xì)胞特征。FBs亞群IFN-FB顯示顯著定位在真皮淺層。朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cells，LC）特征的spots僅分布在表皮和毛囊上皮。pCDs得分高的spots主要分布在毛囊周圍真皮中。CD16+ DC得分高的spots在真皮淺層最密集。結(jié)合以上結(jié)果，再次表明濾泡間上皮的基底狀KCs形成富含IFN皮膚的環(huán)境可以調(diào)節(jié)這些
CD16+ DC。
8. 外周循環(huán)細(xì)胞和皮膚浸潤的髓系細(xì)胞擬時(shí)序分析表明 CD16+DC 來源于狼瘡皮膚中接受干擾素調(diào)控的非典型單核細(xì)胞
針對(duì)PBMC和皮膚組織的髓系細(xì)胞進(jìn)行聚類分析，顯示了髓系細(xì)胞從PBMC跨越皮膚的明顯轉(zhuǎn)變。注釋確定橋接細(xì)胞為 CD14+CD16++非典型單細(xì)胞（nonclassical monocytes，ncMos），其僅來源于PBMC，而CD16+ DCs可以來自PBMC和皮膚。為了了解細(xì)胞群轉(zhuǎn)變伴隨的轉(zhuǎn)錄組變化，進(jìn)行了擬時(shí)序分析，發(fā)現(xiàn)了了從ncMos到CD16+ DC的五種基因表達(dá)模式�；讵�(dú)創(chuàng)性通路分析（ingenuity pathway analysis，IPA）計(jì)算了每個(gè)細(xì)胞中所有細(xì)胞因子其上游的調(diào)節(jié)因子得分；并確定了這些得分與擬時(shí)序的相關(guān)性。結(jié)果顯示I型干擾素組合（IFN-α1/13，IFN-β，IFN-κ）和IFN-γ這些因子均和細(xì)胞群轉(zhuǎn)變有很高的相關(guān)性（r = 0.774，0.880，0.666，0.873）。同時(shí)許多上游調(diào)節(jié)因子在擬時(shí)序中表現(xiàn)出漸進(jìn)性的誘導(dǎo)和更高的相關(guān)性得分，這表明上游因子在細(xì)胞轉(zhuǎn)變中在更早起到作用，其中包括IL-1β（r = 0.928）和TNF（r = 0.903）。
參考文獻(xiàn)：
Billi AC, Ma F, Plazyo O, et al. Nonlesional lupus skin contributes to inflammatory education of myeloid cells and primes for cutaneous inflammation. Sci Transl Med. 2022;14(642):eabn2263.doi:10.1126/scitranslmed.abn2263
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