文章標(biāo)題：Rapid, deep and precise profiling of the plasma proteome with multi-nanoparticle protein corona
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：17.694
作者單位：哈佛醫(yī)學(xué)院；Seer，美國（百趣生物蛋白冠™蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研發(fā)單位）

研究背景
血漿蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性限制了大規(guī)模、無偏的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。該研究報道了一種可拓展、高效的蛋白質(zhì)鑒定和定量平臺——蛋白冠技術(shù)，利用納米顆粒(nanoparticles, NPs)獨特的表面物化特性，可與蛋白組進行獨特的相互作用形成蛋白冠，從而實現(xiàn)血漿蛋白質(zhì)組的深度檢測。在一項關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的分類實驗中，通過5個NPs聯(lián)用，在141個血漿樣本中檢測出2000多種蛋白質(zhì)。本文所描述的技術(shù)即通過蛋白質(zhì)和NPs之間獨特的相互作用，結(jié)合精簡的工作流程，使得高深度、廣覆蓋的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為現(xiàn)實。
 

圖1. 蛋白冠技術(shù)工作流程研究結(jié)果

1.NPs開發(fā)與表征
在蛋白冠的基礎(chǔ)研究中，開發(fā)了超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs, NP)，可以用于蛋白冠的自動化檢測。粒子的超順磁性核心促進蛋白冠與血漿的快速磁分離（<30秒），大大減少了LC-MS/MS提取NP蛋白冠所需的時間。 ，此外，不同的表面修飾，也有助于SPIONs產(chǎn)生不同的冠狀物模式，以更廣泛地研究蛋白質(zhì)組。

根據(jù)先前公布的方法初步合成了3個具有不同表面化學(xué)成分的NPs（SP-003，SP-007和SP-011）（圖2）。 ，利用掃描電子顯微鏡(SEM)，動態(tài)光散射(DLS)，透射電子顯微鏡(TEM)，高分辨率TEM(HRTEM)和x射線光電子能譜(XPS)等技術(shù)對三種NPs的尺寸、形態(tài)和表面特性方面進行表征描述（圖2）。 ，DLS測量結(jié)果與掃描電鏡吻合，三種SPIONs為球形和半球形，平均尺寸均在200-300nm范圍內(nèi)；ζ電位（ζ）分析表面電荷量，顯示pH值為7.4時，ζ值分別為-36.9，+25.8和-0.4mV，代表負(fù)、正和中性表面（圖2）；使用HRTEM評估涂層厚度，

對于SP-003，在氧化鐵芯周圍形成了厚度>10nm的非晶態(tài)殼層（圖2d），對于SP-007和SP-011，形成了相對較�。�<10nm）的非晶形態(tài)外殼（2i，n）；此外，通過XPS進行表面分析，證實了NPs成功包裹了各自的官能團。結(jié)構(gòu)表征證實了三種SPIONs構(gòu)成了一個多樣化的NPs測試集，之后對蛋白質(zhì)的檢測覆蓋率、精度和響應(yīng)線性度進行進一步評估。
 

圖2. 三種SPIONs的結(jié)構(gòu)表征

2.蛋白質(zhì)組學(xué)分析三種NPs的初始效果
使用DDA LC-MS/MS分析3種NPs panel，單個納米顆粒檢出蛋白數(shù)＞500，共檢出蛋白數(shù)＞700（圖3a）。SP-003，SP-007和SP-011三種NPs的中位CVs分別為19.6％、30.3％和17.0％（圖3b）。

為了探索NPs在大范圍濃度范圍內(nèi)檢測血漿蛋白的能力， ，作者將上述三種NPs測量的蛋白質(zhì)特征強度與已發(fā)表的數(shù)據(jù)進行了比較（圖3c），斜率的減小表明蛋白質(zhì)信號強度的動態(tài)范圍隨豐度的變化而減小，即NPs可以通過親和力結(jié)合有效地歸一化蛋白質(zhì)豐度，從而有效地降低蛋白冠中豐度的動態(tài)范圍，有利于低豐度蛋白的檢出。

為了確定平臺在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和驗證研究中的實際響應(yīng)度，作者通過添加其他2種蛋白血管生成素和鈣衛(wèi)蛋白（S100a8/9），包括3個附加的多肽和3個附加的NPs，對響應(yīng)線性度進行了更深入的探索。 ，通過線性回歸對NPs檢測到的數(shù)據(jù)與ELISA結(jié)果進行了建模，證實了線性響應(yīng)，并表明了NP平臺能夠高精度地測量寬動態(tài)范圍內(nèi)肽段/蛋白質(zhì)水平的相對變化。

之后為了探究背景干擾對蛋白冠組成的影響，文章對不同脂質(zhì)水平和溶血程度下形成的蛋白冠進行了檢測。檢測結(jié)果顯示脂質(zhì)水平的高低不會影響蛋白質(zhì)檢出數(shù)量、組成或強度分布。此外還觀察到不同條件下蛋白質(zhì)數(shù)量的穩(wěn)健性，正常血漿中檢測到的重疊蛋白不受溶血引起的巨大背景變化的影響。
 

圖3. 三個原始NPs的蛋白質(zhì)組學(xué)表征

3.十種NPs的優(yōu)化組合
文章基于3種NPs的組合對蛋白質(zhì)的檢測覆蓋率、精度和響應(yīng)線性度進行了評估，之后為進一步拓展蛋白冠的檢測深度，對43個候選SPIONs進行篩選，最終產(chǎn)生一個由10個NPs組成的優(yōu)化panel，CVs分布范圍為16.4％至30.8％（圖4b）。將定量結(jié)果與已發(fā)布的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集進行比較，檢測精度與檢測深度均要高于已發(fā)布的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集。 ，與血漿蛋白數(shù)據(jù)庫的比較結(jié)果顯示，10NPs-panel的蛋白組成幾乎覆蓋了數(shù)據(jù)庫的整個動態(tài)范圍。在目前已知的蛋白標(biāo)志物研究中，多集中分布在高豐度范圍內(nèi)，新型蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物的出現(xiàn)率非常低（每年少于2種），10NPs-panel在90個生物標(biāo)記物中，能夠在每個NPs和純血漿中鑒定出33至43個FDA標(biāo)志物（圖4c），蛋白冠™蛋白質(zhì)組學(xué)對于低豐度生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。

為了確定參考血漿蛋白質(zhì)組中存在的功能類別，由Uniport ID向注釋數(shù)據(jù)庫(GOCC, GOBP, KEGG, Uniprot Keywords, Pfam)進行映射，并比較了10個NPs panel的富集結(jié)果。結(jié)果顯示出在分泌、先天免疫和囊泡等多種功能注釋上的顯著富集（圖4d），以及不同NPs之間在功能富集上的差異性（圖4e）。總的結(jié)果表明，NP冠狀物不僅可以根據(jù)單個蛋白質(zhì)的水平進行分類，還可以根據(jù)蛋白質(zhì)的功能基團進行分類。此外，NP富集不同功能類別蛋白質(zhì)（即細(xì)胞外，細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)）的能力說明了NP冠狀物在復(fù)雜蛋白質(zhì)組中采樣的寬動態(tài)范圍。
 

圖4. 與純血漿相比，優(yōu)化了10個NPs孔板

4.大規(guī)模應(yīng)用：非小細(xì)胞肺癌研究
為了說明蛋白冠技術(shù)在大隊列研究中的應(yīng)用，文章對NSCLC（非小細(xì)胞肺癌）受試者以及與年齡和性別相匹配的健康肺部合并癥對照受試者進行了快速而深入的血漿蛋白質(zhì)組分析（圖5）。從最初的10個NPs中選擇5個組成panel，以最大限度地優(yōu)化蛋白質(zhì)組覆蓋率，進一步減少總的實驗時間。在整個研究過程中使用QC樣品評估精度。結(jié)果表明Proteograph可以在短時間內(nèi)快速評估大量樣本，同時進一步提升精度和廣度。

為了研究早期NSCLC檢測的可能性，對80名健康受試者和61名早期NSCLC受試者組成的樣本集進行了分類建模，141位受試者在5種NPs中平均檢測到1664種蛋白質(zhì)（圖5a），依靠無監(jiān)督的聚類分析，由NPs檢測結(jié)果表現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)豐度模式簇（圖5b）。

作者進一步將研究重點放在NPs中檢測到的而去高豐度蛋白血漿未檢測到的蛋白上，對它們發(fā)揮的作用展開了深入研究，使用隨機森林模型，量化了健康人群與早期NSCLC患者的分類表現(xiàn)，分析數(shù)據(jù)平均AUC為0.91（圖5c），受試者的隨機分類排列平均AUC僅達(dá)到0.51，這證實了分類器結(jié)果中不存在過度擬合的情況。檢查前20個分類器特征(NP和蛋白質(zhì)組的組合)，按特征重要性排序，通過Open Targets(OT)注釋判斷，突出顯示已知和未知的蛋白質(zhì)在NSCLC中發(fā)揮作用（圖5d）。在最重要的特征中，鑒定到了微管蛋白，它是化療藥物(包括紫杉醇及其衍生物)的靶點。此項研究為臨床隊列中使用多個NPs識別蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物提供了參考依據(jù)。
 

圖5. 使用五個NPs對早期NSCLC與健康受試者進行分類

結(jié)論
本文介紹了高通量和自動化的蛋白質(zhì)分離技術(shù)平臺(Proteograph)，該平臺從46種具有不同理化性質(zhì)的NPs中篩選得到一組NPs整合到體外測定中，用于蛋白冠形成和LC-MS/MS分析，以實現(xiàn)無偏蛋白的收集/檢測。使用混樣（pool）血漿作為模型復(fù)雜的生物樣品，驗證了以下假設(shè)：較大的NP panel可識別更多的蛋白質(zhì)，尤其是低豐度蛋白質(zhì)。

在一組10個NPs的panel中發(fā)現(xiàn)了不同的蛋白質(zhì)和與各自蛋白冠相關(guān)的蛋白質(zhì)途徑，表明添加更多不同的NPs可以實現(xiàn)更廣泛和更深入的蛋白質(zhì)組分析，因此類似于基因測序中不同的覆蓋水平，可以通過改變NPs的數(shù)量和類型來定制平臺，以在不同的水平上對蛋白質(zhì)組進行分析。此前研究中使用相同的NP panel檢測到53種FDA批準(zhǔn)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，但這些生物標(biāo)記大多在高豐度范圍內(nèi)被檢測到，鑒于NPs可以檢測到大量的低豐度蛋白，預(yù)測未來的研究將使用組合NPs來鑒定許多新穎的生物標(biāo)記。