科學(xué)根據(jù)一抗的種屬選擇二抗的要點(diǎn)小結(jié)
檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，同時(shí)在后繼試驗(yàn)中也會(huì)有不同的檢測(cè)方案，因此在選擇二抗的時(shí)候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測(cè)方案的要求，其中如何根據(jù)一抗的種屬來源和類型選擇二抗尤為重要。
1. 一抗的種屬來源
二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。
2. 一抗是屬于哪個(gè)類或亞類
除了要與一抗的種屬來源相一致，二抗還需與一抗的類別或亞類相匹配，這通常是針對(duì)單克隆抗體而言。一般來說多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對(duì)復(fù)雜些，由于單克隆抗體有不同的類別和亞型，因此相應(yīng)的二抗也需要根據(jù)這些亞型進(jìn)行選擇。
單克隆抗體的類別及亞類通常會(huì)在產(chǎn)品說明書中都會(huì)有描述，如果您的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgG抗體。如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者您也可以選擇專門針對(duì)這一亞類的二抗，例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，那么您可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應(yīng)物種IgG，因?yàn)榇朔N抗體可以識(shí)別大多數(shù)類型的IgG免疫球蛋白。
下面總結(jié)了幾種具有不同特異性的二抗：
針對(duì)整個(gè)抗體分子（H＋L）具有特異性：
如anti-IgG(H+L)，此類抗體既可以與抗體的重鏈結(jié)合也可以與輕鏈結(jié)合，即與抗體分子的Fc，F(xiàn)(ab')2/Fab部分均可反應(yīng)，anti-IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應(yīng)（如IgM和IgA），因?yàn)樗械拿庖咔虻鞍锥季哂邢嗤妮p鏈（κ鏈或λ鏈）。
針對(duì)Fab片段具有特異性：
這類抗體與重鏈輕鏈均可以結(jié)合，由于它們可以與輕鏈反應(yīng)，它們同時(shí)也可以和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應(yīng)。
針對(duì)Fc片段或重鏈具有特異性：
這類抗體和重鏈的Fc部分反應(yīng)，因此它們是類別特異性的。即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應(yīng)，mu鏈特異性抗體只識(shí)別IgM，依此類推。
輕鏈（lambda，kappa）特異性：
與所有類別的抗體反應(yīng)，因?yàn)樗蓄悇e的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。
經(jīng)過吸附處理的二抗：
不同來源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗一個(gè)物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，因此有些二抗經(jīng)過了動(dòng)物或人類IgG吸附處理，以減少非特異性背景。例如，如果是小鼠的組織或細(xì)胞，那么選擇經(jīng)小鼠血清或IgG吸附處理過的二抗可以減少非特異性結(jié)合。但是此種抗體識(shí)別表位的數(shù)量被大大減少。
3. 二抗的種屬來源
一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)系，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里，如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里，如果其中一個(gè)一抗是山羊來源的，一個(gè)是小鼠來源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時(shí)候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。選擇相應(yīng)的驢來源的二抗，就非常適合做類似雙標(biāo)的免疫實(shí)驗(yàn)。
4. 選擇哪種形式的二抗，是整個(gè)IgG分子，F(xiàn)(ab')2片段，還是Fab片段？
整個(gè)IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。
F(ab')2片段：該種抗體是由兩個(gè)靠二硫鍵連接的用于結(jié)合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況。
Fab片段：它們只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一般用來封閉內(nèi)源性免疫球蛋白。
5. 抗體的純度：
親和層析純化的抗體一般更受人們歡迎，因?yàn)檫@些產(chǎn)品的純度最高，產(chǎn)生的非特異性背景最少。但是有些情況下也要考慮到純化過程中損失的IgG部分，因?yàn)槠渲泻杏H和力很高的抗體，尤其是當(dāng)目的抗原存在的量很小的時(shí)候，高親和性的IgG部分就顯得尤為重要。5. 二抗的耦聯(lián)標(biāo)記
一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團(tuán)（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào)，可以使用biotin/avidin檢測(cè)系統(tǒng)。在一些熒光檢測(cè)方案中，則需要選擇不同的熒光標(biāo)記；而金顆粒標(biāo)記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。
下面簡(jiǎn)單介紹幾種二抗探針的優(yōu)缺點(diǎn)及其適用的實(shí)驗(yàn)：
酶：
主要有兩種不同的酶耦聯(lián)物，HRP和AP。比較而言，前者更經(jīng)濟(jì)、快速、穩(wěn)定，而后者較前者更為靈敏，通常情況下，HRP廣泛應(yīng)用于免疫組化，western blot和ELISA中，而堿性磷酸酶（AP）更適合于固相的免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，如ELISA和western blot.
熒光基團(tuán)：
FITC：FITC是廣泛使用的熒光基團(tuán)，但其最大的缺點(diǎn)是淬滅快，使用抗淬滅劑可以減輕。
AMCA：常用在多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，如免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)。其缺點(diǎn)是，淬滅快，且由于肉眼不能很好的檢測(cè)其所激發(fā)的藍(lán)色熒光，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更適用于檢測(cè)大量存在的抗原。
花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更穩(wěn)定，且在表面熒光顯微鏡下，Cy2的熒光FITC更強(qiáng)。Cy3和Cy5比大多數(shù)熒光基團(tuán)更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。二者常在共聚焦顯微實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。但Cy5的缺點(diǎn)是不能用表面熒光顯微鏡觀察，因此通常用具有遠(yuǎn)紅外檢測(cè)器的共聚焦顯微鏡觀察。
TRITC,RRX,TR：TRITC經(jīng)常和FITC一起用于雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，也可以使用RRX或TR，但TR會(huì)產(chǎn)生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因?yàn)镽RX的發(fā)射波長(zhǎng)在Cy2和Cy5中間，且和這兩者的重疊很少。
PE：常和FITC一起用于流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
6、生物素：
生物素（biotin）可以和抗生素蛋白（avidin）發(fā)生不可逆反應(yīng)而緊密結(jié)合在一起。首先加入生物素標(biāo)記的二抗，在加入耦聯(lián)有酶或熒光集團(tuán)的avidin、ExtrAvidin或streptavidin，后者能夠結(jié)合于二抗表面的多個(gè)位點(diǎn)上，從而極大的放大檢測(cè)信號(hào)。
1. 一抗的種屬來源
二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。
2. 一抗是屬于哪個(gè)類或亞類
除了要與一抗的種屬來源相一致，二抗還需與一抗的類別或亞類相匹配，這通常是針對(duì)單克隆抗體而言。一般來說多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對(duì)復(fù)雜些，由于單克隆抗體有不同的類別和亞型，因此相應(yīng)的二抗也需要根據(jù)這些亞型進(jìn)行選擇。
單克隆抗體的類別及亞類通常會(huì)在產(chǎn)品說明書中都會(huì)有描述，如果您的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgG抗體。如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者您也可以選擇專門針對(duì)這一亞類的二抗，例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，那么您可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應(yīng)物種IgG，因?yàn)榇朔N抗體可以識(shí)別大多數(shù)類型的IgG免疫球蛋白。
下面總結(jié)了幾種具有不同特異性的二抗：
針對(duì)整個(gè)抗體分子（H＋L）具有特異性：
如anti-IgG(H+L)，此類抗體既可以與抗體的重鏈結(jié)合也可以與輕鏈結(jié)合，即與抗體分子的Fc，F(xiàn)(ab')2/Fab部分均可反應(yīng)，anti-IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應(yīng)（如IgM和IgA），因?yàn)樗械拿庖咔虻鞍锥季哂邢嗤妮p鏈（κ鏈或λ鏈）。
針對(duì)Fab片段具有特異性：
這類抗體與重鏈輕鏈均可以結(jié)合，由于它們可以與輕鏈反應(yīng)，它們同時(shí)也可以和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應(yīng)。
針對(duì)Fc片段或重鏈具有特異性：
這類抗體和重鏈的Fc部分反應(yīng)，因此它們是類別特異性的。即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應(yīng)，mu鏈特異性抗體只識(shí)別IgM，依此類推。
輕鏈（lambda，kappa）特異性：
與所有類別的抗體反應(yīng)，因?yàn)樗蓄悇e的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。
經(jīng)過吸附處理的二抗：
不同來源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗一個(gè)物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，因此有些二抗經(jīng)過了動(dòng)物或人類IgG吸附處理，以減少非特異性背景。例如，如果是小鼠的組織或細(xì)胞，那么選擇經(jīng)小鼠血清或IgG吸附處理過的二抗可以減少非特異性結(jié)合。但是此種抗體識(shí)別表位的數(shù)量被大大減少。
3. 二抗的種屬來源
一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)系，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里，如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里，如果其中一個(gè)一抗是山羊來源的，一個(gè)是小鼠來源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時(shí)候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。選擇相應(yīng)的驢來源的二抗，就非常適合做類似雙標(biāo)的免疫實(shí)驗(yàn)。
4. 選擇哪種形式的二抗，是整個(gè)IgG分子，F(xiàn)(ab')2片段，還是Fab片段？
整個(gè)IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。
F(ab')2片段：該種抗體是由兩個(gè)靠二硫鍵連接的用于結(jié)合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況。
Fab片段：它們只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一般用來封閉內(nèi)源性免疫球蛋白。
5. 抗體的純度：
親和層析純化的抗體一般更受人們歡迎，因?yàn)檫@些產(chǎn)品的純度最高，產(chǎn)生的非特異性背景最少。但是有些情況下也要考慮到純化過程中損失的IgG部分，因?yàn)槠渲泻杏H和力很高的抗體，尤其是當(dāng)目的抗原存在的量很小的時(shí)候，高親和性的IgG部分就顯得尤為重要。5. 二抗的耦聯(lián)標(biāo)記
一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團(tuán)（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào)，可以使用biotin/avidin檢測(cè)系統(tǒng)。在一些熒光檢測(cè)方案中，則需要選擇不同的熒光標(biāo)記；而金顆粒標(biāo)記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。
下面簡(jiǎn)單介紹幾種二抗探針的優(yōu)缺點(diǎn)及其適用的實(shí)驗(yàn)：
酶：
主要有兩種不同的酶耦聯(lián)物，HRP和AP。比較而言，前者更經(jīng)濟(jì)、快速、穩(wěn)定，而后者較前者更為靈敏，通常情況下，HRP廣泛應(yīng)用于免疫組化，western blot和ELISA中，而堿性磷酸酶（AP）更適合于固相的免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，如ELISA和western blot.
熒光基團(tuán)：
FITC：FITC是廣泛使用的熒光基團(tuán)，但其最大的缺點(diǎn)是淬滅快，使用抗淬滅劑可以減輕。
AMCA：常用在多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，如免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)。其缺點(diǎn)是，淬滅快，且由于肉眼不能很好的檢測(cè)其所激發(fā)的藍(lán)色熒光，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更適用于檢測(cè)大量存在的抗原。
花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更穩(wěn)定，且在表面熒光顯微鏡下，Cy2的熒光FITC更強(qiáng)。Cy3和Cy5比大多數(shù)熒光基團(tuán)更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。二者常在共聚焦顯微實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。但Cy5的缺點(diǎn)是不能用表面熒光顯微鏡觀察，因此通常用具有遠(yuǎn)紅外檢測(cè)器的共聚焦顯微鏡觀察。
TRITC,RRX,TR：TRITC經(jīng)常和FITC一起用于雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，也可以使用RRX或TR，但TR會(huì)產(chǎn)生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因?yàn)镽RX的發(fā)射波長(zhǎng)在Cy2和Cy5中間，且和這兩者的重疊很少。
PE：常和FITC一起用于流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
6、生物素：
生物素（biotin）可以和抗生素蛋白（avidin）發(fā)生不可逆反應(yīng)而緊密結(jié)合在一起。首先加入生物素標(biāo)記的二抗，在加入耦聯(lián)有酶或熒光集團(tuán)的avidin、ExtrAvidin或streptavidin，后者能夠結(jié)合于二抗表面的多個(gè)位點(diǎn)上，從而極大的放大檢測(cè)信號(hào)。
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