研究結(jié)果
1. CRLM, HCC, and CRC 樣本數(shù)據(jù)收集及免疫特征
對(duì)于CRLM，文章共獲取了來自101個(gè)匹配樣本的CD45+細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)，這些匹配樣本包括原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤（Pri.CT）、鄰近結(jié)腸（Adj.Col）、腸系膜淋巴結(jié)（MLN）、肝轉(zhuǎn)移（Liv.Mets）、鄰近肝臟（Adj.Liv）和17例初治患者的外周血。文章分別基于10x Genomics和Smart-seq2獲得了323,444和5,004個(gè)單細(xì)胞的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組。10X 5'和3'平臺(tái)都捕獲了大多數(shù)主要的免疫細(xì)胞，包括CD4+和CD8+ T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NKT細(xì)胞、NK細(xì)胞、γo T細(xì)胞、DC、肥大細(xì)胞、B細(xì)胞、3型先天淋巴樣細(xì)胞（ILC3s）和少量CD45-細(xì)胞（圖1）。此外，使用Scanpy在每個(gè)主要細(xì)胞群中進(jìn)行無監(jiān)督聚類，共鑒定出78個(gè)免疫細(xì)胞亞群（圖1B和1C）。由于同時(shí)分析原發(fā)性HCC/CRC和CRLM腫瘤對(duì)于解剖癌細(xì)胞和器官在形成TME時(shí)的相互作用至關(guān)重要，文章結(jié)合了來自18例初治非轉(zhuǎn)移性CRC患者的49例樣本和16例初治非轉(zhuǎn)移性HCC患者的51例樣本的scRNAseq數(shù)據(jù)。為了統(tǒng)一所有數(shù)據(jù)，本文使用SciBet對(duì)CRC和HCC樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了重新聚類，這使本研究能夠基于CRLM數(shù)據(jù)集預(yù)測(cè)細(xì)胞類型。
 

圖1 CRLM, HCC, and CRC 樣本數(shù)據(jù)收集及免疫特征

2. 利用表型比對(duì)方法解開癌細(xì)胞和宿主器官對(duì)TME的影響
在沒有CRLM數(shù)據(jù)的情況下，本文單獨(dú)對(duì)原發(fā)性HCC/CRCs的正常和腫瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行了方差分析，以確定某些免疫細(xì)胞群是否傾向于與正常/腫瘤狀態(tài)或肝臟/結(jié)腸位置相關(guān)（圖2A）。文章發(fā)現(xiàn)CD4_Treg-CTLA4，CD8_Tex-LAYN和Mph-C1QC是與宿主組織腫瘤或正常相關(guān)的前三個(gè)聚類（p< 0.001, ANOVA檢驗(yàn);圖2A），在HCC和CRC腫瘤中均表現(xiàn)出高于相應(yīng)鄰近部位的浸潤(rùn)（圖2B）。這表明這些細(xì)胞可能受到惡性狀態(tài)的影響。此外，CD8-MKI67、CD4_Treg-IL10和Mph-SPP1也受到腫瘤的影響（p< 0.01, ANOVA檢驗(yàn);圖2A）其中，與Adj.Cols和HCC腫瘤相比，Mph-SPP1在CRC腫瘤中富集（圖2B）。KLRB1+組織常駐記憶（Trm)）CD8+T和黏膜相關(guān)不變T細(xì)胞（MAIT）在HCC腫瘤和Adj.Livs中占主導(dǎo)地位，而上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（iel）和Mph-NLRP3在CRC腫瘤和Adj.Cols中表現(xiàn)出更高的豐富度（圖2A）。這表明這些細(xì)胞可能受到了居住組織的影響。雖然HCC和CRCs之間的直接比較顯示惡性腫瘤和器官微環(huán)境可能共同形成免疫浸潤(rùn)，但由于癌癥類型之間的組間差異，>50%免疫亞群（如Th17和cDC2簇）也明顯與惡性腫瘤或器官微環(huán)境無關(guān)（圖2A）。在解釋惡性腫瘤的影響時(shí)，HCC和CRC癌細(xì)胞之間的差異以及患者之間的遺傳背景差異也可能使結(jié)果復(fù)雜化。此外，基于方差分析的分析僅使用頻率信息，而忽略單細(xì)胞表達(dá)譜。因此，本文的目標(biāo)是通過合并CRLM數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析來解決上述復(fù)雜性，因?yàn)橄嗤�的癌�?xì)胞譜系存在于同一患者的不同組織位置。

雖然方差分析可以利用樣本的統(tǒng)計(jì)學(xué)效力來說明免疫浸潤(rùn)水平與惡性腫瘤及器官類型的關(guān)系，但由于每例患者作為一個(gè)樣本處理，樣本數(shù)較少，無法建立轉(zhuǎn)移部位免疫細(xì)胞與原發(fā)腫瘤及腫瘤鄰近肝組織免疫細(xì)胞之間的表型聯(lián)系。因此，因此本文設(shè)計(jì)PhenoAligner方法來剖析肝轉(zhuǎn)移免疫細(xì)胞與其他組織的表型聯(lián)系。PhenoAligner的假設(shè)是，在不同組織中具有相似轉(zhuǎn)錄組表型的細(xì)胞可能具有相似的微環(huán)境或生態(tài)位，因此可能共享外部調(diào)節(jié)因子以形成相似的表型。

在主要免疫細(xì)胞群體水平上，PhenoAligner顯示81%的CD45- Cells被歸類為原發(fā)性結(jié)直腸癌相關(guān)（圖2D），這與CD45人群中癌細(xì)胞的主要存在以及這些癌細(xì)胞的相同起源相一致。肥大細(xì)胞被定性為“惡性腫瘤相關(guān)”M型。NKT和NK細(xì)胞、DCs 和T 細(xì)胞被定義為N型（圖2D）。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被定義為C型（圖2D）。
 

圖2 利用表型比對(duì)方法解開癌細(xì)胞和宿主器官對(duì)TME的影響

3. CD8+耗竭細(xì)胞與惡性腫瘤相關(guān)且依賴于TCR
盡管CD8+T細(xì)胞在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中被分配為N型，根據(jù)PhenoAligner分析，他們的子集顯示出不同的模式(圖3A, 3B)。在所有CD8+ T簇中，兩個(gè)Tex簇Tex-LAYN和Tex- MKI67被鑒定為N型，因?yàn)樗鼈兊谋硇痛蠖嗯c原發(fā)性結(jié)直腸癌一致（圖3A）。這些Tex在兩個(gè)腫瘤位點(diǎn)也顯示富集。Tex-MKI67與Tex-LAYN共享多個(gè)T細(xì)胞受體（TCR）克隆型和相似的基因表達(dá)，也高表達(dá)增殖基因，因此，Texs主要受惡性細(xì)胞的影響。

為了進(jìn)一步評(píng)估原發(fā)性結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移部位T細(xì)胞是否同源，文章在原發(fā)位和轉(zhuǎn)移位中Tex-LAYN細(xì)胞群中分別識(shí)別到172和149種TCR克隆型，有42種在兩個(gè)癌點(diǎn)都有存在。表明Tex表現(xiàn)出惡性排他性，并且含有潛在識(shí)別腫瘤抗原的TCRs。令人困惑的是，Texs是如何從原發(fā)位“遷移”到轉(zhuǎn)移位的。據(jù)報(bào)道，Texs大都流動(dòng)性非常低。一種可能的解釋是，兩個(gè)腫瘤部位的Texs起源于相同的前體，并以TCR依賴的方式對(duì)相同的癌癥相關(guān)抗原起反應(yīng)。

為了進(jìn)一步探究Texs在原發(fā)位和轉(zhuǎn)移位之間的關(guān)聯(lián)，文章進(jìn)一步檢測(cè)了Tex和其他T細(xì)胞簇之間的TCR共享。結(jié)果顯示不僅Temras和效應(yīng)記憶T細(xì)胞(Tems)之間存在TCR共享，Tems和Texs之間也存在TCR共享。此外，RNA速率分析顯示Temras和Tems之間存在雙向流動(dòng)，而Tems向Texs的分化似乎是不可逆的(圖3F)。這些觀測(cè)結(jié)果表明，Tems具有高度塑性和中間性質(zhì)，可能是M型Texs的前身。即DC呈遞抗原給Tn，分化為temra，分別到達(dá)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的腫瘤位置，進(jìn)而分化為tem，tem浸潤(rùn)進(jìn)腫瘤細(xì)胞并耗竭，無法再起到t細(xì)胞的作用。Tems的這種中間過渡可能是CD8+T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)過程中的重要橋梁步驟，并可能為之前提出的癌癥免疫周期提供新的見解(圖3G)。
 

圖3 CD8+耗竭細(xì)胞與惡性腫瘤相關(guān)且依賴于TCR

4. 結(jié)直腸惡性腫瘤和肝臟生態(tài)位對(duì)CD4+ T細(xì)胞亞群有不同的影響
接下來，本文對(duì)CD4+ T細(xì)胞進(jìn)行了類似的分析，觀察到T輔助細(xì)胞（Th）17、Th1-like 、Treg-IL10和Treg-CTLA4被定性為M型（圖4A和4B）。Th17在原發(fā)位中富集，IL23R、RORC和ITGAE高表達(dá)。Th1樣高表達(dá)CXCL13和PDCD1。對(duì)于三個(gè)Treg群體，Treg- foxp3對(duì)應(yīng)血液中的Treg，其他兩個(gè)對(duì)應(yīng)組織中的Treg。在組織富集的Treg群體中，Treg-IL10高表達(dá)腸內(nèi)Treg標(biāo)記物，包括IL10、IL23R和IL1R1(圖4C)，在結(jié)直腸癌癌旁和結(jié)直腸癌原發(fā)灶中高度豐富，而在肝正常和肝轉(zhuǎn)移中罕見。相比之下，與Treg激活相關(guān)的Treg- ctla4高表達(dá)基因包括LAYN、CCR8和TIGIT（圖4C），與它們的免疫抑制性質(zhì)一致。此外，與非轉(zhuǎn)移性CRC腫瘤相比，CRLM患者結(jié)直腸癌原發(fā)灶中Treg-IL10和Treg-CTLA4的比例明顯升高（圖4D），表明原發(fā)性CRC腫瘤伴隨肝轉(zhuǎn)移。與非轉(zhuǎn)移性CRC腫瘤相比，可能表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫抑制性，這與小鼠模型得出的結(jié)果一致。

從理論上講，這四種M型簇可以由播種癌細(xì)胞塑造，具有兩種不同的機(jī)制:起源于相同的前體，由癌癥相關(guān)的抗原觸發(fā)或被不同來源的癌細(xì)胞招募。Treg-CTLA4和Th1-like 中的TCRs在原發(fā)位和肝轉(zhuǎn)移之間顯示出顯著的共享。（圖4F）。值得注意的是，在所有CD4+T細(xì)胞簇中，只有Treg-CTLA4在原發(fā)位和肝轉(zhuǎn)移之間顯示出更高的STARTRAC-migr指數(shù)。Mets比腫瘤和其他組織之間的指數(shù)高（圖4H）。此外，兩個(gè)腫瘤位點(diǎn)的Treg-CTLA4與Treg-FOXP3共享TCR克隆型。此外，RNA速率分析顯示了從Treg-FOXP3到Treg-CTLA4的轉(zhuǎn)變方向（圖4l），這表明血液中靜止的Treg可能遷移到兩個(gè)腫瘤部位，然后在TME中被激活和擴(kuò)張。與Th1-like和Treg-CTLA4不同，其余兩個(gè)簇（Treg-IL10和Th17）的TCRs在原發(fā)位和肝轉(zhuǎn)移之間表現(xiàn)出互斥模式（圖4G）。因此，這兩種機(jī)制都存在于CD4+T細(xì)胞中。Th17和Treg-IL10被不同來源的腫瘤細(xì)胞募集，而Treg-CTLA4和Th1-like來自同一前體。
 

圖4 結(jié)直腸惡性腫瘤和肝臟生態(tài)位對(duì)CD4+ T細(xì)胞亞群有不同的影響

結(jié)論
研究者更進(jìn)一步探索了cDC2亞群的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)DC3和cDC2-TIMP1在腫瘤中富集，DC3傾向于富集在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中，而cDC2-TIMP1則更多地出現(xiàn)于肝轉(zhuǎn)移灶中。過往的研究提到DC3在外周血、脾臟和扁桃體中存在，研究者首次在CRLM患者中發(fā)現(xiàn)該亞群，DC3和其他三個(gè)TAM亞群共同被歸類為M-type。C1QC+ TAM具有促炎性和抗腫瘤的特性，而SPP1+ TAM主要存在于轉(zhuǎn)移灶并且具有極高的促血管生成潛能，可以促進(jìn)CRC腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。該研究為探索不同類型的腫瘤中免疫微環(huán)境的特異性和其形成原因提供了范式。

參考文獻(xiàn)：
Liu Y, Zhang Q, Xing B, Luo N, Gao R, Yu K, Hu X, Bu Z, Peng J, Ren X, Zhang Z. Immune phenotypic linkage between colorectal cancer and liver metastasis. Cancer Cell. 2022 Apr 11;40(4):424-437.e5. doi: 10.1016/j.ccell.2022.02.013. Epub 2022 Mar 17. PMID: 35303421.