苯并[c]噻吩熒光團的抗猝滅NIR-II J聚集體實現(xiàn)高效生物成像光療診斷

瀏覽次數(shù)：901　發(fā)布日期：2023-4-19　來源：恒光智影

本文要點：具有第二近紅外（NIR-II）發(fā)射的分子熒光團由于其優(yōu)異的生物相容性和高分辨率，在深層組織生物成像方面具有巨大的潛力。最近，J-聚集被用于構(gòu)建長波長NIR-II發(fā)射器，因為它們的光帶在形成水分散性納米聚集體時顯示出顯著的紅移。然而，由于J型主鏈的種類有限和嚴重的熒光猝滅，它們在NIR-II熒光成像中的廣泛應(yīng)用受到了阻礙。在此，我們報道了一種具有抗猝滅效應(yīng)的明亮的苯并[c]噻吩（BT）J聚集熒光團（BT6），用于高效的NIR-II生物成像和光療診斷。BT熒光團被操縱以具有超過400nm的斯托克斯位移和聚集誘導(dǎo)發(fā)射（AIE）特性，以克服J型熒光團的自猝滅問題。在水性環(huán)境中形成BT6組件后，800nm以上的吸收和1000nm以上的NIR-II發(fā)射分別提高了41倍和26倍以上。全身血管的體內(nèi)可視化和圖像引導(dǎo)的光療結(jié)果證明BT6 NP是NIR-II熒光成像和癌癥光熱療法的優(yōu)秀試劑。本研究開發(fā)了一種策略，以構(gòu)建具有精確操縱的抗菌性能的明亮NIR-II J聚集體，用于高效生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

1.簡介：

在過去的十年里，第二近紅外窗口（NIR-II，900-1700 nm）中的熒光生物成像由于其高分辨率、低組織自發(fā)熒光以及深組織穿透性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很大的前景。目前，許多NIR-II熒光材料，如量子點、碳納米管、稀土摻雜納米顆粒（NP）和有機小分子已經(jīng)成功構(gòu)建。其中，共軛小分子由于其優(yōu)越的生物相容性和強的近紅外（NIR）吸收，在體內(nèi)醫(yī)學(xué)診斷和光療方面表現(xiàn)出非凡的優(yōu)勢。然而，它們的實際應(yīng)用往往因熒光亮度不令人滿意而受到阻礙。

與單體狀態(tài)相比，J聚集體顯示出紅移的吸收和發(fā)射帶，這可用于開發(fā)高效的NIR-II發(fā)射體。然而，大多數(shù)報道的熒光團在形成納米顆粒后顯示出H型或無序聚集，由于其剛性和平面分子結(jié)構(gòu)，近紅外吸收和熒光性能減弱。只有少數(shù)類型的熒光團具有J型填充特性，如二吡咯甲基硼（BODIPY）、花青、方胺和苝雙酰亞胺。最近，基于傳統(tǒng)的J型分子骨架開發(fā)了幾種NIR-II發(fā)射J聚集體。它們的吸收和發(fā)射帶紅移到更長的波長區(qū)域，這有利于體內(nèi)生物成像。盡管如此，J-聚集體在NIR-II熒光成像中的廣泛應(yīng)用受到J-型主鏈種類有限的阻礙。此外，由于難以避免的自猝滅效應(yīng)，先前報道的NIR-II J聚集體的熒光產(chǎn)率對于實現(xiàn)有效的生物成像是不令人滿意的。因此，強烈需要開發(fā)用于NIR-II熒光成像的具有明亮熒光的新型J型發(fā)射材料。

自猝滅效應(yīng)是影響近紅外熒光團成像性能的主要問題之一。例如，花青和方酸染料的斯托克斯位移通常低于100nm，這導(dǎo)致它們發(fā)射的光子的不可避免地被自吸收。此外，由于聚集引起的猝滅（ACQ）效應(yīng)，許多報道的具有疏水性特征的NIR-II小分子在形成水分散性納米顆粒時往往顯示出嚴重降低的亮度。因此，開發(fā)具有抗猝滅能力的NIR-II熒光團對于實現(xiàn)高質(zhì)量的體內(nèi)生物成像具有重要意義。據(jù)我們所知，由于缺乏合適的分子主干和實現(xiàn)抗猝滅能力的問題，此類J聚集體尚未報道。

作為概念驗證，我們首先制備了苯并[c]噻吩（BT）基衍生物BT3，這在我們之前的研究中有報道。[47]由于強烈的電子推拉效應(yīng)，它表現(xiàn)出強烈的第一近紅外（NIR-I，700-900nm）吸收和NIR-II發(fā)射，斯托克斯位移為156nm。在水中形成納米聚集體后，BT3 NP在吸收和發(fā)射方面表現(xiàn)出有趣的紅移，說明了J聚集特性。然而，BT3單體的明亮熒光由于ACQ效應(yīng)而被嚴重猝滅。然后，我們在苯并[c]-噻吩和BT3的二聚胺之間引入二甲基亞苯基，以產(chǎn)生具有較大結(jié)構(gòu)畸變的BT6分子。由于延長的供體和增加的供體-受體（D-A）構(gòu)象扭曲，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）效應(yīng)大大改善，這將BT6的斯托克斯位移延長到326 nm（方案1）。在形成水分散性NP后，BT6 NP顯示出優(yōu)選的J型聚集，其提供紅移吸收，并且808nm處的吸光度從其分離的分子增加了41倍。此外，由于聚集誘導(dǎo)發(fā)射（AIE）效應(yīng)，NIR-II熒光增強了26倍，峰值從953 nm紅移到1054 nm。因此，我們的分子設(shè)計策略可以同時實現(xiàn)兩個目標(biāo)：增加的斯托克斯位移和AIE效應(yīng)，這可以有效地解決熒光團的自猝滅問題。同時，BT6NP在808nm激光照射下可產(chǎn)生大量活性氧（ROS）和放熱來用于癌癥光療。所開發(fā)的BT6 NP成功應(yīng)用于全身血管的NIR-II熒光成像和成像引導(dǎo)的小鼠腫瘤光療�？傊狙芯客ㄟ^調(diào)節(jié)Stokes位移和聚集體的發(fā)射行為，構(gòu)建了一個明亮的苯并噻吩J聚集體，用于體內(nèi)NIR-II生物成像和癌癥熱分析，同時為合理設(shè)計具有抗猝滅性能的熒光團提供了范例。更重要的是，BT6分子是用一種新型的D-A配置的主鏈構(gòu)建的，該主鏈賦予NIR-II發(fā)射體J聚集。這肯定會豐富J-聚集體庫，并激勵該領(lǐng)域的進一步發(fā)展。先前報道的NIR-II發(fā)射BT衍生物主要基于具有供體-受體-供體（D-A-D）構(gòu)型的苯并雙噻二唑（BBTD）核（圖S1，支持信息）。相比之下，目前新開發(fā)的具有D-A配置的BT核心將為NIR-II發(fā)射器設(shè)計提供新的見解。

方案1. 用于光電療法的BT分子設(shè)計和J型BT6 NP的示意圖。a） BT分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的吸收/發(fā)射譜，顯示BT6分子在300nm以上的斯托克斯位移增加。b） BT NP的制備及其在聚集體中的排放行為。c）通過Jablonski圖和體內(nèi)NIR-II生物成像和成像引導(dǎo)的癌癥光療描述BT6單體和J聚集NP的光物理機制。Abs：吸收。Em：排放。ISC：系統(tǒng)間交叉。M：單體。J：J型骨料。FLI：熒光成像。PDT：光動力療法。PTT：光熱療法。

2.結(jié)果

2.1 BT分子的設(shè)計、合成和表征。

新分子BT6被設(shè)計為在BT3的二聚胺和苯并[c]噻吩之間具有鄰位二甲基亞苯基橋，以探索延伸供體鏈段和空間扭曲構(gòu)象對光物理性質(zhì)以及分子間相互作用的影響。支持信息中描述了BT6的合成。三芳基胺1是通過4-溴-2,3-二甲基苯胺和4-碘甲苯的典型Pd催化的C-N鍵偶聯(lián)反應(yīng)以65%的產(chǎn)率獲得的。在Pd（PPh3）2Cl2作為催化劑的存在下，1和2的Stille偶聯(lián)反應(yīng)得到產(chǎn)物3，其用于原位制備錫基中間體4，方法是用四丁基氟化銨（TABF）處理以去除TIPS基團，然后加入n-BuLi進行去質(zhì)子化，然后用Bu3SnCl進行錫基化。4和醛5之間的Stille偶聯(lián)反應(yīng)得到醛6，醛6通過Knöevenagel縮合進一步轉(zhuǎn)化為BT6。詳細的合成程序和結(jié)構(gòu)特征見支持信息（圖S2-S5，支持信息）。BT3的合成過程和結(jié)構(gòu)特征可以在以前的工作中找到。

首先對BT3和BT6分子進行密度泛函理論（DFT）和時間相關(guān)DFT（TD-DFT）模擬，以了解它們的光物理性質(zhì)。圖1顯示了他們計算的最高占據(jù)分子軌道（HOMO）、最低未占分子軌道（LUMO）和優(yōu)化的幾何結(jié)構(gòu)。在BT6中，HOMO定位在富電子的三芳基胺（TAA）供體上，LUMO分布在缺電子的受體上。相反，在BT3中，HOMO和LUMO電子密度分布在整個分子骨架上。BT6中D和A之間較大的空間位阻導(dǎo)致61.8°的大二面角和分離良好的邊界軌道。這些給出了0.35 eV的小ΔEst，這應(yīng)該有利于提高其在光動力治療（PDT）中的性能（圖S6，支持信息）。此外，與BT3（信通技術(shù)的49%）相比，BT6擁有更高效的信通技術(shù)（占信通技術(shù)的93.6%）。因此，BT6在四氫呋喃（THF）中的斯托克斯位移為326 nm，比BT3（156 nm）大得多（圖S7，支持信息）。他們優(yōu)化的基態(tài)（S0）和第一單線態(tài)激發(fā)態(tài)。

圖1. BT分子的理論模擬。BT3和BT6分子的供體（紅色）-受體（藍色）結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)計算的HOMOs/LUMO，HOMO的ICT百分比→LUMO躍遷，以及S0和S1狀態(tài)下優(yōu)化的分子幾何結(jié)構(gòu)與均方根位移（RMSD）之間的比較。（S1）幾何形狀也在圖1中進行了比較。在1.234和1.141的大均方根位移（RMSD）值的激勵下，有明顯的幾何變化Å 分別用于BT3和BT6。這種幾何弛豫提供了用于在去激發(fā)時產(chǎn)生熱量的通道，這對于光熱治療（PTT）是有益的。

2.2 聚合狀態(tài)下的聚合行為

疏水分子通常被組裝成水分散性納米顆粒，以提高其膠體穩(wěn)定性和體內(nèi)循環(huán)時間。由于激子動力學(xué)的改變，最初的單體財產(chǎn)經(jīng)常在共組裝時發(fā)生改變。因此，需要對聚集體的財產(chǎn)有一個清晰的了解，以便其進一步的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。為了研究BT3和BT6分子在聚集態(tài)下的熒光財產(chǎn)，測量了不同水含量（fw）的THF/水混合物的光致發(fā)光（PL）光譜。如圖2a和圖S8a（支持信息）所示，BT3在純THF中溶解時具有較強的發(fā)射。隨著fw從0%增加到60%，其發(fā)射強度略有上升。當(dāng)fw進一步增加到70%及以上時，BT3的發(fā)射強度由于聚集體的形成而急劇降低，表明其ACQ特性。相比之下，BT6顯示出不同的發(fā)射行為，如圖2a和圖S8b所示（支持信息）。當(dāng)BT6溶解在0-60%fw的THF/水混合物中時，它幾乎是不發(fā)射的，因為它以單體狀態(tài)存在，并且TAA轉(zhuǎn)子可以自由旋轉(zhuǎn)。有趣的是，發(fā)射強度隨著fw的進一步升高而增加，達到70%及以上。由于轉(zhuǎn)子整體旋轉(zhuǎn)的限制，熒光增強，證明了其AIE特性。從ACQ（BT3）到AIE（BT6）的熒光行為的改變有利于有效的體內(nèi)生物成像。為了追溯這種變化的原因，對它們的分子結(jié)構(gòu)進行了綜述。如圖1所示，BT3顯示D和a之間的二面角為36.5°。相比之下，BT6具有更長的主鏈和更扭曲的結(jié)構(gòu)，TAA和BT基團之間的二面角為61.8°，兩個BT基團之間為42°。BT6中的這種扭曲結(jié)構(gòu)是由于在亞苯基上引入了兩個甲基，這在很大程度上增加了分子內(nèi)的空間位阻。扭曲的幾何形狀防止BT6在聚集時面對面π-π堆積，從而保留其NIR-II熒光。值得注意的是，盡管最近有幾篇關(guān)于在D-A-D型分子中將NIR-II排放從ACQ轉(zhuǎn)化為AIE的報道；到目前為止，還沒有關(guān)于簡單的D-A分子的這樣的報道。更有趣的是，值得注意的是，從未報道過對J聚集系統(tǒng)的聚集物排放行為的這種操縱。

為了更好地理解BT6分子的聚集行為，研究了BT6在不同fw的THF/水混合物中的吸收。如圖2b所示，當(dāng)fw從0增加到99%時，BT6紅的吸收峰從627 nm移動到653 nm，在700 nm以上的區(qū)域出現(xiàn)吸收肩。結(jié)果表明，BT6單體形成J聚集體，在聚集體狀態(tài)下具有紅移吸收的特征。為了進一步闡明BT6的聚集特征，通過與美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的Pluronic F127（聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷，PEO-PPO-PEO）共組裝來制備水分散性納米顆粒。這種共聚物輔助的納米組裝體可以增強體內(nèi)生物相容性和腫瘤積聚。同時，還制備了BT6純膜和單晶，以全面研究其聚集財產(chǎn)。如圖2c所示，與THF中的游離BT6單體相比，吸收峰和發(fā)射峰都顯示出不同水平的紅移。NP的吸收最大值移動到652nm，這與在THF/水混合物中形成的聚集體中觀察到的現(xiàn)象一致。該結(jié)果還表明BT6的這種J型聚集是相對穩(wěn)定的，并且不受在聚集物中包括PEO-PPO-PEO的影響。BT6薄膜在687nm處具有更大的紅移吸收最大值。來自NP分散體的發(fā)射顯示出類似的紅移。在固態(tài)發(fā)射中，晶體具有比膜態(tài)更長的波長PL峰值，這可能是由于其更規(guī)則的J型堆疊。BT6的這種紅移吸收和發(fā)射可以提供深層組織穿透、低組織損傷和改善體內(nèi)應(yīng)用的生物成像性能。

圖2.BT聚集體的聚集行為和光譜特征。a） BT3和BT6在具有不同水分數(shù)的THF/水混合物中的光致發(fā)光強度（I/I0）的變化。插圖：BT3和BT6在含0和90%水餾分的THF/水混合物中的NIR-II熒光圖像。b） BT6在具有不同水分數(shù)的THF/水混合物中的吸收光譜。c）不同J型BT6聚集體的吸收光譜和熒光光譜。d）BT6的X射線晶體結(jié)構(gòu)。e） BT6晶體中具有滑移角和分子間距離的分子堆積模式。為了清楚起見，省略了溶劑分子。f）計算晶體中BT6分子的靜電勢表面。g）計算晶體中BT6二聚體的非共價相互作用。

然后通過單晶結(jié)構(gòu)分析研究BT6中的分子堆積模式（圖2d、圖S9和表S1，支持信息）。BT6單晶表現(xiàn)出三斜結(jié)構(gòu)（空間群：P-1）。如圖2e和圖S10（支持信息）所示，BT6二聚體顯示出典型的滑移堆積，分子間距離為3.5Å，滑移角為17°，小于J型填料所需的魔角54.7°。[16] BT6的計算靜電勢（ESP）圖表明，負π-電荷主要分布在氰基的氮原子上，而正π-電荷則主要分布在另一部分（圖2f）。此外，供體具有扭曲的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有大的空間位阻，因此不能容易地與相鄰分子包裝。因此，BT6傾向于通過靜電相互作用通過兩個單體的平面受體部分堆積在一起，產(chǎn)生BT6二聚體（圖2e）。對BT6晶體二聚體進行了進一步的理論計算，以探索分子間的相互作用。如圖2g和圖S11（支持信息）所示，相鄰分子主要通過晶體二聚體內(nèi)的范德華力和空間效應(yīng)相互作用。據(jù)我們所知，到目前為止，NIR-II發(fā)射J聚集染料都是基于三種傳統(tǒng)J型主鏈之一：花青、方堿或BODIPY（表S2，支持信息）。因此，值得注意的是，這項工作報道了一種新型的分子骨架，用于設(shè)計具有J聚集的NIR-II發(fā)射體。

2.3 BT NP的光物理性質(zhì)

對BT3和BT6納米顆粒進行表征，以探索其光物理性質(zhì)。如圖3a所示，BT3納米顆粒的尺寸為38納米，而BT6納米顆粒的大小為44納米，這也通過使用透射電子顯微鏡（TEM）得到了證實。它們相應(yīng)的NP水分散體既透明又透明，說明它們具有良好的膠體穩(wěn)定性。通過在室溫下記錄一個月的粒徑，進一步驗證了BT6 NP的膠體穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在整個測試期間，粒徑保持不變（圖S12，支持信息）。由于Pluronic F127共聚物的存在，BT3和BT6 NP都具有負ζ電位（圖S13，支持信息）。進一步表征了BT3和BT6 NP在水中的吸收光譜和熒光光譜。如圖3b所示，BT6分子顯示出比BT3分子更短的波長吸收，而它們的發(fā)射位于900nm以外的相同區(qū)域，這表明BT6分子的斯托克斯位移為326nm。與THF中的單體相比，BT3和BT6 NP的吸收和發(fā)射波長都顯示出明顯的紅移。特別是，在形成J型NP后，BT6在808nm處的吸收被有效地增強了~41倍，這有利于NIR 808nm激光激發(fā)。從單體溶液和相應(yīng)的NP分散體之間的顏色變化也可以觀察到這些有趣的吸光度變化（圖S14，支持信息）。此外，BT3和BT6的發(fā)射峰在形成NP后都延伸到1050nm以上，這有利于體內(nèi)生物成像。值得注意的是，BT6的斯托克斯位移在形成NP后增加到402nm，這可以最大限度地減少熒光的自猝滅。先前報道的具有大斯托克斯位移的NIR-II發(fā)射器總結(jié)在表S3中（支持信息）。據(jù)我們所知，BT6 NP在具有明亮NIR-II熒光的有機分子中顯示出最長的斯托克斯位移。此外，BT6 NP作為自由分子重新溶解在THF中，以證明其在形成NP后的穩(wěn)定性。如圖S15所示（支持信息），分解的BT6的吸收峰與THF中的游離BT6分子一致，驗證了其在NP制備過程中的化學(xué)特性不變。

圖3. BT NP的光物理財產(chǎn)。a） BT3和BT6 NP的尺寸分布。左側(cè)插圖：BT3和BT6 NP水分散體。右插圖：BT6納米顆粒的TEM圖像。比例尺：100納米。b） THF中BT3和BT6分子及其相應(yīng)NP在水中的歸一化吸收和發(fā)射光譜。c）具有不同長通（LP）濾光片的BT3 NP（100μg mL-1）、BT6分子（100μgmL-1）和BT6 NP（100微克mL-1）的NIR-II熒光圖像。激發(fā)源：808nm激光。d） NIR-II熒光強度與BT6 NPs濃度之間的定量關(guān)系（n=4）。插圖：不同濃度的BT6 NP的NIR-II熒光圖像。激發(fā)源：808nm激光。e） IR1061（在DCM中）、BT3分子（在THF中）、BT3 NP（在水中）和BT6 NP（在水中）在808nm處具有五個光密度（OD）值的積分光致發(fā)光（PL）強度的圖，以及它們相應(yīng)的光致發(fā)光量子產(chǎn)率。f）在808nm激光照射（0.33W cm-2）0至10分鐘（n=4）的情況下，水中BT6 NP和ICG的相對NIR-II熒光強度變化。插圖：具有不同照射持續(xù)時間的BT6 NP和ICG的NIR-II熒光圖像。g）在808nm激光（0.1W cm-2）照射10分鐘下，水中BT6 NP和ICG的ROS產(chǎn)生。指示劑：DCFH。h）不同濃度（0、30、60、90、120μg mL-1）的BT6 NP在808 nm激光（1 W cm-2）照射5分鐘后的紅外熱像圖。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

使用880和1000nm長通（LP）濾光片記錄BT3 NP、BT6分子和BT6 NP的熒光圖像，以研究成像性能（圖3c）。由于ACQ特征，BT3 NP在這兩種情況下幾乎沒有顯示熒光，而BT6 NP即使使用880nm和1000nm LP濾光片也具有強烈的聚集誘導(dǎo)熒光，證明了NIRII生物成像的潛力。如圖S16（支持信息）所示，BT在不同介質(zhì)中的熒光性能沒有明顯變化。可能的原因是NP中的分子已經(jīng)與聚合物基質(zhì)組裝在一起，其中基質(zhì)限制了分子的運動，避免了與周圍介質(zhì)的接觸。在808nm激光激發(fā)下，進一步測量了不同濃度的BT6 NP分散體的發(fā)射強度（圖3d）。結(jié)果表明，BT6 NP的NIR-II熒光信號隨著濃度的增加而線性增加，說明了定量成像的能力。然后，通過將BT3和BT6材料的NIR-II光致發(fā)光量子產(chǎn)率（PLQY）與作為標(biāo)準(zhǔn)參考的IR1061材料（PLQY:1.70%在DCM中）進行比較來評估它們。如圖3e和圖S17（支持信息）所示，BT3在THF中顯示出1.88%的良好PLQY，而其在水中的NP由于猝滅效應(yīng)而具有0.03%的非常低的PLQY。BT6分子在THF中的PLQY無法評估，因為其在808nm處的吸光度較差。相反，水中的BT6 NP在808nm激光激發(fā)下具有0.97%的高PLQY，這適合于體內(nèi)生物成像。此外，通過使用吲哚菁綠（ICG，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的NIR熒光成像染料）作為808nm激光照射下的比較，研究了BT6 NP的熒光穩(wěn)定性。如圖3f所示，BT6 NP的熒光強度在照射10分鐘后略有下降16.0%，而ICG僅在照射6分鐘后就迅速降解96.4%。結(jié)果表明，BT6 NP的光穩(wěn)定性比臨床使用的成像染料好得多，這表明BT6 NP適用于體內(nèi)生物成像。

由于BT6具有低ΔEST，它可能產(chǎn)生用于腫瘤PDT的細胞毒性ROS。使用2′，7′-二氯熒光素（DCFH）作為熒光探針，進一步評估了近紅外激活的BT6 NP的ROS產(chǎn)生。如圖3g和圖S18（支持信息）所示，BT6 NP在808nm輻射下具有良好的ROS生成，這是水中ICG的17倍。如圖3h和圖S19（支持信息）所示，BT6 NP在808nm激光激發(fā)下也表現(xiàn)出良好的光熱性能。當(dāng)濃度為120μg mL-1時，NPs水分散體的溫度在照射5分鐘后迅速升高，達到約60℃的高溫，遠遠超過癌癥細胞壞死所需的溫度（42℃）。在水組中幾乎沒有溫度升高，這表明808nm的水的光的吸收是最小的，因此引起最小的組織損傷。BT6 NP的光熱轉(zhuǎn)換效率（PCE，η）進一步確定為36%（圖S20，支持信息），驗證了良好的光熱效應(yīng)。表S4總結(jié)了BT3和BT6單體及其NP的關(guān)鍵光物理參數(shù)（支持信息）。利用飛秒瞬態(tài)（fs-TA）光譜測量方法研究了BT6的激發(fā)態(tài)動力學(xué)。BT6分子在THF中在580-620nm處的動力學(xué)曲線顯示，在13.9ps處有一個衰變組分（圖S21和表S5，支持信息）。這種相對短壽命的衰變分量與報道的非輻射衰變壽命相匹配。還研究了水中BT6 NP的fs-TA光譜（圖S22，支持信息）。聚集BT6分子后產(chǎn)生新的成分。其中，超快的兩種衰變（0.08ps和3.02ps）是非輻射衰變成分，屬于光熱效應(yīng)。75.5ps的相對長壽命組分是1O2生成的熒光通道和三重態(tài)激發(fā)態(tài)，這在游離BT6分子中是不存在的。因此，分子的聚集產(chǎn)生了具有長壽命的新通道，用于產(chǎn)生NIR-II熒光和1O2。

此外，通過記錄加熱/冷卻循環(huán)，研究了BT6 NP的光熱穩(wěn)定性。如圖S23（支持信息）所示，在5個輻照周期后，BT6 NP的溫度僅略有下降，而在相同條件下，ICG的溫度衰減嚴重。在一個月的儲存期內(nèi)，BT6 NP的吸光度變化可以忽略不計，這也證明了長期儲存的穩(wěn)定性（圖S24，支持信息）。許多報道的J聚集體僅在室溫下的特定溶劑環(huán)境中具有穩(wěn)定性，并且可能在包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的生理溶液中由于分子間相互作用或高溫而被破壞。因此，進一步研究了BT6 NP在Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）和人血清白蛋白（HSA）混合物中的穩(wěn)定性。如圖S25（支持信息）所示，即使在37℃下孵育48小時，BT6 NP在DMEM/HSA混合物中的吸收也僅略有下降，證明了穩(wěn)定的J型聚集。因此，這些結(jié)果表明，BT6-NP是一種優(yōu)越的光療劑，可用于進一步的體外試驗。

圖4. BT6納米顆粒的體外光療性能。a）不同條件下4T1細胞中ROS生成的共聚焦熒光圖像。探針：DCFH-DA用于ROS染色，Hoechst 33342用于細胞核染色。比例尺：50μm。b）不同處理后用鈣黃綠素AM和同二聚乙錠-1染色的A549細胞的共聚焦熒光圖像。比例尺：100μm。c） 4T1和d）A549細胞在808nm激光（1W cm-2）處理9分鐘（n=4）下的BT6 NP濃度依賴性生存能力。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2.4 體外活性氧評價與抗癌性能

使用2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）作為ROS探針檢測細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，同時用Hoechst 33342染料對細胞核進行染色。如圖4a和圖S26（支持信息）所示，僅PBS組、PBS+激光組和僅BT6 NPs組的4T1癌癥細胞沒有顯示ROS氧化的2'，7'-二氯熒光素（DCF）的綠色熒光信號，表明細胞內(nèi)沒有ROS生成。相比之下，激光照射組的BT6 NP中的4T1細胞顯示出隨著照射時間的推移逐漸增加的綠色熒光。BT6 NP的細胞內(nèi)ROS生成能力也在A549和Hela細胞中進行了評估，顯示出與4T1細胞系相同的結(jié)果（圖S27和S28，支持信息）。這些結(jié)果表明，BT6NP在激光照射下可以進入多種癌癥細胞并有效地產(chǎn)生活性氧。通過活/死細胞染色進一步研究BT6 NPs的抗癌性能，其中綠色鈣黃綠素AM染色活細胞的細胞質(zhì)，而紅色乙炔同二聚體-1染色死細胞的細胞核。如圖4b所示，僅PBS組、PBS+激光組和僅BT6 NPs組的細胞質(zhì)內(nèi)觀察到亮綠色熒光，表明這些組沒有抗癌作用。相比之下，BT6 NPs+激光組的細胞核內(nèi)觀察到亮紅色熒光，說明其具有優(yōu)異的光動力和光熱抗癌性能。還使用4T1和A549癌癥細胞系進行了標(biāo)準(zhǔn)MTT檢測，以證明BT6 NPs的細胞殺傷性能。如圖4c所示，當(dāng)在808nm激光照射下與50μg mL-1的BT6 NP孵育時，4T1細胞顯示出顯著降低的生存能力，降至約6%。相反，在僅BT6 NP組中，4T1細胞活力僅顯示出輕微下降至87%。同樣，BT6 NPs+激光組A549癌癥細胞的存活率也較低，而僅NPs組保持良好的細胞存活率（圖4d）。這些結(jié)果表明，BT6納米粒可用于不同癌癥細胞的近紅外光激活光療，具有低暗毒性，可用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

2.5 體內(nèi)NIR-II熒光成像

圖5. 血管和腫瘤的體內(nèi)NIR-II熒光成像。a）使用BT6 NP進行全身血管成像，BT6 NP具有不同的高通濾波器和相應(yīng)的半最大全寬分析。激發(fā)源：793nm激光。比例尺：20mm。b）體內(nèi)NIR-II熒光圖像和c）靜脈注射BT6 NP后4T1荷瘤小鼠在0、3、6、12、24、36、48、72、，和96小時。d）離體NIR-II熒光圖像和e）在注射BT6 NP后36小時從4T1荷瘤小鼠切除的不同器官和腫瘤的相應(yīng)熒光強度（n＝3）。激發(fā)源：808nm激光。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

由于BT6 NP具有優(yōu)異的NIR-II發(fā)射，因此使用InGaAs探測器進行全身血管成像以評估大深度成像性能。如圖5a所示，注射BT6 NP后，小鼠的血管可以被識別。值得注意的是，與使用900nm LP濾波器拍攝的成像圖像相比，使用1300nm和1100nm LP濾波器的成像圖像顯示出顯著改善的對比度和明顯減少的背景干擾。同時，繪制血管的NIR II熒光強度以展示橫截面強度分布。很明顯，半峰全寬（FWHM）從使用900nm LP濾波器的0.49mm減小到使用1300nm LP濾光片的0.38mm，驗證了通過使用更長波長成像增強的成像分辨率。

NIR-II熒光成像也可用于指導(dǎo)體內(nèi)光療，以優(yōu)化治療效果。如圖5b所示，在注射BT6 NP后的不同時間點收集4T1荷瘤裸鼠的體內(nèi)NIR-II熒光圖像。腫瘤部位的熒光強度隨著時間的推移而增強，并在注射后36小時達到最大值，這可以作為最佳光療傳導(dǎo)時間點（圖5c）。此外，在注射后36小時從小鼠身上切除主要器官和腫瘤組織，以進行離體熒光成像。如圖5d和e所示，NIR-II熒光信號主要分布在肝臟和腫瘤組織中，表明BT6 NP可以在腫瘤部位積累。

2.6 體內(nèi)光療療效

良好的體外實驗結(jié)果鼓勵我們通過使用BT6 NP進一步進行體內(nèi)光療。通過使用靜脈注射BT6 NP的4T1荷瘤裸鼠，然后在注射后36小時進行808nm激光激發(fā)，來研究體內(nèi)光治療性能。使用紅外熱成像相機記錄BT6 NP腫瘤部位的光致發(fā)熱。如圖6a和圖b所示，在5分鐘808nm光照射下，僅PBS組的溫度僅略有升高3.4°C。相反，在相同的處理條件下，BT6 NP組可以觀察到溫度迅速升高到50°C左右，這對于光熱處理來說足夠高。如圖6c、d和圖S29（支持信息）所示，由于光誘導(dǎo)的ROS和BT6 NP的發(fā)熱，BT6 NPs+激光組顯示出顯著的腫瘤根除效果。與PBS對照組相比，PBS+激光和僅BT6 NP組中的小鼠腫瘤顯示出相似的大小，這意味著僅激光治療或僅注射NP不能提供抗腫瘤效果。還通過測量從治療開始的腫瘤體積來記錄整個治療期。如圖6e所示，BT6 NPs+激光組小鼠的腫瘤生長在前兩天的光療治療后得到有效抑制，在接下來的12天內(nèi)沒有明顯的復(fù)發(fā)。然而，PBS、PBS+激光和僅BT6 NP組中的腫瘤在整個兩周的治療期間顯示出持續(xù)生長。此外，每2天記錄不同組小鼠的體重，以研究治療的體內(nèi)毒性。不同組的所有小鼠體重相似，在治療過程中略有增加，這在一定程度上意味著BT6 NP的生物安全性（圖6f）。

圖6. BT6 NP對4T1荷瘤小鼠的體內(nèi)光療性能。a）紅外熱圖像和b）在注射PBS或BT6 NP后36小時，用808nm激光照射不同時間的4T1荷瘤小鼠的相應(yīng)溫度分布。激發(fā)源：808nm激光，1 W cm-2。c）小鼠和d）不同治療組在第14天的腫瘤圖像。e）不同治療組14天的腫瘤生長曲線（n=5）。f）治療期間不同治療組的小鼠體重（n=5）。g） H&E和TUNEL染色。比例尺：200μm。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P值通過使用Tukey檢驗的單因素方差分析計算，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.00

為了進一步研究治療的療效和生物相容性，系統(tǒng)地進行了組織學(xué)染色和血液分析。如圖6g所示，BT6 NPs+激光組的腫瘤組織蘇木精和伊紅（H&E）染色顯示，腫瘤細胞嚴重破壞，壞死明顯，這在其他組中沒有發(fā)現(xiàn)。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）結(jié)果進一步說明了BT6 NPs+激光組中癌癥細胞的明顯凋亡，這在其他組中沒有觀察到。這些結(jié)果證實了808nm激光照射的BT6 NP可導(dǎo)致嚴重的腫瘤細胞死亡。此外，還對用各種制劑處理的小鼠的各種器官（包括心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）進行H&E染色。如圖S30（支持信息）所示，特定器官的所有染色組都顯示出相似的結(jié)果，反映出沒有明顯的器官損傷。最后，從四組小鼠中采集血液，進行血液生物化學(xué)和完整的血型分析。如圖S31（支持信息）所示，BT6 NPs+激光組的所有測量參數(shù)與其他組相比均無顯著差異，表明肝毒性和腎毒性可忽略不計。此外，兩組的完整血液參數(shù)也顯示出相似的結(jié)果，進一步驗證了BT6 NP的體內(nèi)生物安全性（圖S32，支持信息）。

3.結(jié)論

總之，我們開發(fā)了一種新型的NIR-II放射J聚集納米粒子（BT6 NP），具有抗猝滅財產(chǎn)，用于高效的體內(nèi)生物成像和癌癥光熱研究。分子設(shè)計策略可以同時實現(xiàn)大的斯托克斯位移和AIE效應(yīng)。這兩個特征有效地解決了先前報道的NIR-II J聚集體的猝滅問題，并在BT6 NP中提供超過1050nm的明亮發(fā)射和402nm的大斯托克斯位移。此外，BT6NP還可以在808nm激光照射下產(chǎn)生ROS和熱量，用于癌癥光療。體內(nèi)實驗全面證明BT6 NPs是NIR-II熒光成像和成像引導(dǎo)癌癥光療的優(yōu)秀試劑。因此，本研究說明了具有精確調(diào)諧光物理財產(chǎn)的J聚集NIR-II發(fā)射器的設(shè)計范例。我們預(yù)計，這種策略將為構(gòu)建用于生物成像應(yīng)用的明亮NIR-II發(fā)射J聚集體鋪平道路。

參考文獻

Lee, K. W., Gao, Y., Wei, W. C., Tan, J. H., Wan, Y., Feng, Z., et al. (2023). Anti-Quenching NIR-II J-Aggregates of Benzo[c]thiophene Fluorophore for Highly Efficient Bioimaging and Phototheranostics. Adv Mater, e2211632.

⭐️ ⭐️ ⭐️

近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS

NIR-II in vivo imaging system