慢性粒細(xì)胞白血病（CML）是一種骨髓增殖性疾病，表現(xiàn)為成熟和未成熟的粒細(xì)胞不受調(diào)控的異常增殖，導(dǎo)致外周血白細(xì)胞大量增生。CML起源于白血病干細(xì)胞（LSC，CD34+CD38-lin-cells）群體。LSCs存在于骨髓微環(huán)境（BMM）中，與正常的造血干細(xì)胞（HSCs）共存。在疾病進(jìn)展過程中，HSCs被LSCs及其子代取代。研究已經(jīng)表明，白血病細(xì)胞會(huì)改變其周圍的生態(tài)位，例如，通過誘導(dǎo)促炎環(huán)境，為LSC的自我更新、分化和存活創(chuàng)造寬松的空間。

血管微環(huán)境已被確定為CML發(fā)展的重要因素。在小鼠模型中觀察到，惡性腫瘤建立后骨髓（BM）中血管化增加，在CML患者的BM 中同樣，這提示其與預(yù)后不良有關(guān)。據(jù)報(bào)道，在CML小鼠模型中，BM內(nèi)皮細(xì)胞可以調(diào)節(jié)白血病干細(xì)胞和祖細(xì)胞的靜息和增殖。然而，這一觀察結(jié)果尚未在原代人類細(xì)胞中得到評(píng)估。

在墨西哥國立自治大學(xué)、墨西哥塞古羅社會(huì)研究所的一項(xiàng)報(bào)告中，描述了原始白血病細(xì)胞與內(nèi)皮集落形成細(xì)胞（ECFC）的共培養(yǎng)，作為白血病細(xì)胞與血管微環(huán)境相互作用的體外模型，以分析內(nèi)皮細(xì)胞對維持CML患者干細(xì)胞和祖細(xì)胞的影響。

與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)可維持原始 CML 細(xì)胞

基于血管微環(huán)境能夠調(diào)節(jié)小鼠惡性造血的事實(shí)，實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)體外模型，其中人內(nèi)皮細(xì)胞（EC）與富含干細(xì)胞和祖細(xì)胞（認(rèn)為是原始細(xì)胞）的CML細(xì)胞群共培養(yǎng)。如圖1 a，CML細(xì)胞與EC的共培養(yǎng)對CML細(xì)胞有維持作用。在沒有EC（對照）的情況下沒有觀察到這種效果。值得注意的是，當(dāng)在沒有內(nèi)皮細(xì)胞但存在造血刺激因子（細(xì)胞因子對照）的情況下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，CML細(xì)胞群的總數(shù)量翻了一番。

內(nèi)皮細(xì)胞與CML細(xì)胞共培養(yǎng)，不接觸或接觸，都導(dǎo)致Lin-CD34+ CD38- 細(xì)胞水平分別比初始細(xì)胞數(shù)增加110%和170%（圖1 b）。后者與細(xì)胞因子對照中的增加相似。在對照培養(yǎng)（僅基礎(chǔ)培養(yǎng)基）中，Lin-CD34+ CD38- 細(xì)胞的數(shù)量減少（圖1 b）。在Lin-CD34+ CD38+ 細(xì)胞中，當(dāng)它們與EC接觸時(shí)觀察到增加了 20%。這種增加在細(xì)胞因子對照培養(yǎng)中沒有發(fā)生，并且與陰性對照和無接觸共培養(yǎng)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中細(xì)胞群的總數(shù)量減少了一半（圖1 c）。

為了確定共培養(yǎng)對集落形成細(xì)胞（CFC）水平的影響，進(jìn)行了集落測定。圖1 d顯示當(dāng)白血病細(xì)胞與EC接觸時(shí)，CFC水平得以維持；相比之下，在無接觸共培養(yǎng)中，CFC水平降低了50%。在細(xì)胞因子對照和僅基礎(chǔ)培養(yǎng)基對照中，CFC數(shù)量分別減少了65%和83%（圖1 d）。此外，在無接觸共培養(yǎng)中，觀察到大多數(shù)集落對應(yīng)于骨髓（CFU-G和CFU-M）和晚期紅系（CFU-E）集落，而在接觸共培養(yǎng)中，觀察到高比例的BFU-E，CFU GM和CFU-Mix集落，這表明直接接觸共培養(yǎng)有利于更原始祖細(xì)胞的存活。

為了鑒定可能參與培養(yǎng)中白血病細(xì)胞維持的可溶性因子，在培養(yǎng)3天后對上清液進(jìn)行了多重分析。在無接觸共培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)與骨髓分化相關(guān)的炎性細(xì)胞因子和可溶性分子的大量產(chǎn)生。另一方面，在直接接觸培養(yǎng)中，炎癥分子的分泌減少，僅觀察到高水平的IL-1a，IL-6和SCF（圖1 e）。值得注意的是，所有這些細(xì)胞因子都參與CML細(xì)胞維持。這些數(shù)據(jù)表明，與內(nèi)皮細(xì)胞的接觸有利于維持培養(yǎng)中的CML原始細(xì)胞。
  （A）在EC共培養(yǎng)三天后評(píng)估總CML細(xì)胞數(shù)。（B）共培養(yǎng)3天后評(píng)估干細(xì)胞（Lin-CD34+ CD38-）或（C）祖細(xì)胞（Lin-CD34 + CD38 +）細(xì)胞數(shù)。（D）共培養(yǎng)三天后，將3000個(gè)造血細(xì)胞在甲基纖維素中傳代培養(yǎng)14天，并評(píng)估CFC。（E）通過多重分析物測定進(jìn)行細(xì)胞因子檢測。

白血病干細(xì)胞仍然附著在內(nèi)皮細(xì)胞上

基于上述結(jié)果，表明內(nèi)皮細(xì)胞和CML原始細(xì)胞之間直接接觸的重要性，因此接下來專注于直接接觸共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)觀察到，在共培養(yǎng)3天后，檢測到兩種不同的造血細(xì)胞：一部分由直接附著在內(nèi)皮上的造血細(xì)胞（cc貼壁）組成，占總細(xì)胞的15.9%，第二部分留在共培養(yǎng)的上清液中（cc非貼壁），占細(xì)胞的84%（圖2 a、b）。有趣的是，這些比例在正常造血細(xì)胞的培養(yǎng)中有很大的不同（圖2 a），其中附著在內(nèi)皮上的細(xì)胞數(shù)量較多（40.2%）。

當(dāng)在每個(gè)共培養(yǎng)組中分析細(xì)胞免疫表型時(shí)，以不同的頻率檢測到干細(xì)胞、祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞（圖2 c、d）。在貼壁部分中，16%，61% 和 22% 分別顯示干細(xì)胞，祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞免疫表型。在非貼壁部分中，具有干細(xì)胞，祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞免疫表型的細(xì)胞百分比分別為9%，74% 和17%。值得注意的是，Lin-CD34+ CD38+ 細(xì)胞的增加與評(píng)估的CFC數(shù)量相關(guān)（圖2 e）。

考慮到CD26已被作為是 CML干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，因此在共培養(yǎng)的總造血細(xì)胞以及直接接觸共培養(yǎng)物的貼壁和非貼壁組中評(píng)估了其表達(dá)。圖2 f顯示，在EC存在3天和6天后，lin-CD34+ CD38- CD26+ 細(xì)胞的水平分別增加50%和120%。與這一結(jié)果一致的是，3天后在附著和非附著到內(nèi)皮的細(xì)胞中檢測到CD26的表達(dá)（圖2 g），而成熟細(xì)胞的數(shù)量（CD34- Lin+，圖2 d）和骨髓細(xì)胞（CD14+，圖2 h）細(xì)胞減少。

當(dāng)使用MEG-01 CML細(xì)胞系（人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞系）時(shí)，也觀察到了類似的結(jié)果。事實(shí)上，干細(xì)胞群優(yōu)先富集貼壁部分（從0時(shí)的0.25% 到共培養(yǎng)3天后的1.34%）。這些結(jié)果表明，在培養(yǎng)系統(tǒng)中，分化和未分化的CML細(xì)胞可能對內(nèi)皮細(xì)胞具有不同的親和力。 （A）CML和NBM接觸共培養(yǎng)中貼壁和非貼壁造血細(xì)胞的百分比。（B）與貼壁（右）和非貼壁（左）細(xì)胞組共培養(yǎng)的代表性照片。（C）代表性點(diǎn)圖和（D）在實(shí)驗(yàn)開始（零時(shí)間）和三天后不接觸（對照）或存在EC時(shí)，分別分析貼壁和非貼壁部分部分的不同CML種群的百分比。（E）共培養(yǎng)三天后，將3000個(gè)造血細(xì)胞在甲基纖維素中傳代培養(yǎng)14天并評(píng)估CFC。（F）CML干細(xì)胞CD26+ 在共培養(yǎng)3天和6天后進(jìn)行評(píng)估，以及（G）貼壁和非貼壁部分。（H）CD14+ 髓系細(xì)胞的百分比。

與EC共培養(yǎng)可調(diào)控CML LSC的增殖狀態(tài)

為了確定EC在CML增殖和干細(xì)胞免疫表型保留中的作用，在24、48和72 h用CFSE多重染色跟蹤C(jī)ML 細(xì)胞（CD45+）和干細(xì)胞（CD34+ CD38-）群，并在EC存在下共培養(yǎng)3天后跟蹤原始免疫表型標(biāo)記。

圖3表明，在MEG-01細(xì)胞系的總CML群中，保持附著在EC上的部分具有最高的增殖潛力（圖3 a，紅色直方圖），與細(xì)胞分裂指數(shù)的顯著增高相關(guān)（圖3 b）。在原代CML細(xì)胞總?cè)褐杏^察到相同的結(jié)果（圖3 d，紅色直方圖和3 e），但在正常骨髓細(xì)胞中未檢測到，其中貼壁和非貼壁細(xì)胞顯示出相似的增殖，也具有相似的細(xì)胞分裂指數(shù)。

當(dāng)跟蹤來自MEG-01細(xì)胞系（CD34+ CD38-）和一個(gè)CML原代樣品（lin-CD34+ CD38-）的干細(xì)胞群時(shí)，相對于非貼壁細(xì)胞，粘附在內(nèi)皮層的部分觀察到更多的細(xì)胞分裂（圖3 a、d）。這種增殖能力比之前描述的CML細(xì)胞總數(shù)更明顯。與這一結(jié)果一致，MEG-01細(xì)胞的貼壁部分的細(xì)胞分裂指數(shù)高于非貼壁部分的干細(xì)胞（圖3 c）。此外，在保持粘附于EC上的CML原代細(xì)胞樣品中，具有干細(xì)胞和祖細(xì)胞免疫表型的細(xì)胞總數(shù)相對于CML對照中的初始數(shù)量增加了4倍和1.7倍（圖3 f、g）。這些結(jié)果表明，白血病干細(xì)胞具有在內(nèi)皮微環(huán)境中保留和增殖的特殊能力，即使它們存在于貼壁部分中。

為了驗(yàn)證與EC接觸的Lin-CD34+ CD38- 的增殖能力，在每次共培養(yǎng)結(jié)束時(shí)評(píng)估細(xì)胞周期狀態(tài)。結(jié)果表明，與EC接觸72 h后，G0期貼壁細(xì)胞數(shù)量相對于0時(shí)增加5倍，而S/G2/M期數(shù)量減少。相反，非貼壁部分的細(xì)胞增殖期（S/G2/M）增加（圖3 h、i）。這些結(jié)果與正常骨髓細(xì)胞的結(jié)果不同，其中靜息細(xì)胞群在共培養(yǎng)前后保持相似，表明這種行為是CML細(xì)胞獨(dú)有的，并且取決于細(xì)胞接觸。

有趣的是，G0 期粘附在EC上的細(xì)胞中有29.5% 顯示出干細(xì)胞表型，相比之下，非粘附部分中只有 2.7% 的G0細(xì)胞顯示出干細(xì)胞表型（圖3 j）。此外，在活躍的細(xì)胞周期階段（S/G2/M）未觀察到具有干細(xì)胞表型的細(xì)胞，其中最高百分比（90%）對應(yīng)于祖細(xì)胞（圖3 j）。

這些結(jié)果表明，內(nèi)皮微環(huán)境可以誘導(dǎo)CML干細(xì)胞的增殖和/或靜息，這可能與兩個(gè)細(xì)胞系之間建立的相互作用類型有關(guān)。
  （A）來自MEG-01細(xì)胞系或（D）原代CML樣品的總或干細(xì)胞群中培養(yǎng)24，48和72小時(shí)的CFSE測定的代表性直方圖。MEG-01細(xì)胞系（B）群體和（C）干細(xì)胞群（CD38 + CD34-）在共培養(yǎng)24、48和72小時(shí)時(shí)的細(xì)胞分裂指數(shù)。（E）共培養(yǎng)3天后的原代CML總細(xì)胞。共培養(yǎng)72小時(shí)后具有（F）干細(xì)胞（Lin-CD34+ CD38-）和（G）祖細(xì)胞（Lin-CD34+ CD38 +）免疫表型的細(xì)胞數(shù)量。（H）在不同共培養(yǎng)條件3天后一個(gè)CML樣品的代表性點(diǎn)圖。（I）細(xì)胞周期階段的倍數(shù)變化。（J）每個(gè)共培養(yǎng)條件和細(xì)胞周期階段不同造血亞群的百分比。

與EC共培養(yǎng)后改變細(xì)胞因子譜和Notch 表達(dá)

為了解釋白血病細(xì)胞在內(nèi)皮微環(huán)境中的持久性，在共培養(yǎng)3天后分析了它們的細(xì)胞因子譜。圖4 a表明，與對照（無接觸共培養(yǎng)）相比，可溶性因子（例如：IL-1a，IL-6和PIGF）顯著增加，這些因子與白血病有關(guān)，以犧牲正常的造血能力為代價(jià)�？赡芤�發(fā)慢性炎癥并引起促白血病微環(huán)境的分子，如IL-8、TGF-b1、GM-CSF和MCP-1，也顯著升高。這種情況可能與觀察到的增殖有關(guān)，但不一定能解釋細(xì)胞的靜息。

考慮到在小鼠模型中粘附分子（如Notch1及其配體）參與CML干細(xì)胞和祖細(xì)胞的維持，因此實(shí)驗(yàn)分析了共培養(yǎng)組、MEG-01細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞中Notch1、Jagged 2 和DLL4的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)72小時(shí)后，白血病細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中Notch-1和 Jagged-2 表達(dá)增加（圖4 b）。該時(shí)間點(diǎn)（72小時(shí)）與細(xì)胞周期G0期白血病細(xì)胞停滯的時(shí)刻相關(guān)，盡管肯定還有其他分子參與其中，但這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，在人類CML中，內(nèi)皮微環(huán)境為維持白血病造血?jiǎng)?chuàng)造了合適的場所，并且干細(xì)胞的靜息和增殖，即使在粘附條件下，也可能與通過直接接觸和可溶性因子分泌物建立的通訊有關(guān)，這會(huì)導(dǎo)致白血病的持久性。 （A）共培養(yǎng)3天后評(píng)估共培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子濃度。（B）采用流式細(xì)胞術(shù)分析共培養(yǎng)24、48和72h后內(nèi)皮細(xì)胞和MEG-01細(xì)胞系中Notch1、Jagged-2 和DLL4的表達(dá)。

總之，這項(xiàng)研究表明，原始CML細(xì)胞和正常內(nèi)皮細(xì)胞之間的共培養(yǎng)，沒有任何額外因素的情況下，產(chǎn)生了一個(gè)微環(huán)境，通過它們的靜息狀態(tài)、增殖和分化，允許原始CML細(xì)胞在體外的維持，這似乎與炎癥環(huán)境的產(chǎn)生有關(guān)，以及它們自身的粘附能力，可能涉及 Notch1-Jagged2 軸。在這種情況下，有必要使用源自CML骨髓的內(nèi)皮細(xì)胞來評(píng)估這些相同的生物效應(yīng)，其中觀察到的效果可能更大，因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞可能已經(jīng)具有功能改變。

參考文獻(xiàn)：Torres-Barrera P, Moreno-Lorenzana D, Alvarado-Moreno JA, García-Ruiz E, Lagunas C, Mayani H, Chávez-González A. Cell Contact with Endothelial Cells Favors the In Vitro Maintenance of Human Chronic Myeloid Leukemia Stem and Progenitor Cells. Int J Mol Sci. 2022 Sep 7;23(18):10326. doi: 10.3390/ijms231810326. PMID: 36142235; PMCID: PMC9499491.

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