文章標(biāo)題：Transcriptomics and metabolomics changes triggered by exogenous 6-benzylaminopurine in relieving epicotyl dormancy of Polygonatum cyrtonema Hua seeds
發(fā)表期刊：Frontiers in Plant Science
影響因子：6.627
作者單位：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
百趣提供服務(wù)：植物阿趣廣靶®代謝組學(xué)

研究背景
多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)是一種藥食同源的多年生植物，它是治療糖尿病和哮喘的重要中藥，含有類黃酮和多糖，對(duì)抗疲勞和治療糖尿病有一定作用。但是黃精種子具有“雙重休眠”的特征，即胚根休眠和上胚軸休眠；因此，在自然條件下，黃精種子需要經(jīng)歷兩個(gè)冬天才能順利出苗，而且繁殖周期非常長(zhǎng)，這大大限制了大規(guī)模種植。植物激素在植物休眠解除中起著重要作用，6-芐基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine, 6-BA)是一種合成細(xì)胞分裂素，通常用于緩解植物的休眠。在本研究中，我們使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析了外源6-BA處理后黃精種子的差異。

技術(shù)路線

研究結(jié)果 1、6-BA處理對(duì)黃精種子外觀和形態(tài)指標(biāo)的影響

形態(tài)學(xué)觀察表明（圖1），黃精種子的發(fā)芽率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)發(fā)芽率達(dá)到60%（30天）時(shí)，發(fā)芽率增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定；當(dāng)6-BA濃度為100～300mg/L時(shí)，效果明顯，最佳濃度為200mg/L。處理組在14天時(shí)種子相繼發(fā)芽，28天后出苗率達(dá)到60%以上，根部逐漸伸長(zhǎng)。但從同一時(shí)期的水分對(duì)照組來(lái)看，進(jìn)入上胚軸休眠后，上胚軸芽伸長(zhǎng)不明顯，21天才開(kāi)始有少量種子發(fā)芽，出苗率始終低于10%；但根生長(zhǎng)迅速，14天后比處理組長(zhǎng)。
 

圖1. 測(cè)定黃精種子種子發(fā)芽和出苗形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

2、種子萌發(fā)過(guò)程中黃精的代謝特征
通過(guò)植物阿趣廣靶®代謝組學(xué)（由百趣生物提供）鑒定了21種樣品（0天-C0、12小時(shí)，7天，28天-C1/T1,C2/T2,C3/T3）代謝物的變化。在樣本中共檢測(cè)到1000種代謝物，包括229種差異代謝物(DEM)。PCA和Venn圖分析顯示（圖2A-D），不同時(shí)間段的處理組和對(duì)照組之間存在顯著差異，其中黃酮類物質(zhì)存在顯著差異。

通過(guò)KEGG功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，處理組和對(duì)照組在12小時(shí)、7天和28天標(biāo)記了25、33和5條代謝途徑（圖2E-G）。可以看出，類黃酮生物合成途徑、精氨酸和脯氨酸代謝途徑在三個(gè)階段顯著富集。此外，玉米素生物合成在前兩個(gè)階段也顯著富集，表明這些代謝途徑或代謝產(chǎn)物與休眠解除密切相關(guān)。
 

圖2. 黃精種子上胚軸休眠解除的代謝組學(xué)分析

3、黃精種子不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組分析
使用與代謝檢測(cè)分析相同樣品，構(gòu)建了21個(gè)cDNA文庫(kù)，并進(jìn)行了高通量RNA-seq分析。通過(guò)三個(gè)不同階段的比較分析（圖3），作者總共獲得了31533個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)。3486、2928和9293個(gè)DEG被發(fā)現(xiàn)是上調(diào)基因，而3213、5221和7392個(gè)DEG分別屬于下調(diào)基因（圖3A-B）。有2718、4544和6795個(gè)DEG分別在T1與C1、T2與C2和T3與C3的組間比較中差異表達(dá)。
 

圖3. 不同階段黃精種子的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

4、代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法分析了黃精種子上胚軸休眠解除過(guò)程

4.1、黃精種子上胚軸休眠解除過(guò)程中類黃酮生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝以及玉米素生物合成途徑中基因和代謝產(chǎn)物的變化（圖4）
在6-BA處理解除黃精種子上胚軸休眠的過(guò)程中，與同一時(shí)期的對(duì)照組相比，前7天通過(guò)抑制類黃酮生物合成途徑的基因和代謝產(chǎn)物來(lái)解除對(duì)芽分化的抑制，并促進(jìn)生長(zhǎng)素相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)上胚軸芽的伸長(zhǎng)。在后期，生長(zhǎng)素合成基因的表達(dá)受到促進(jìn)類黃酮相關(guān)基因和代謝產(chǎn)物的抑制，這進(jìn)一步抑制了根系生長(zhǎng)，促進(jìn)了種子向種子出苗的轉(zhuǎn)化。也有報(bào)道稱類黃酮在種子萌發(fā)過(guò)程中積累，這表明，黃精種子上胚軸休眠解除和萌發(fā)的分子機(jī)制不同。

精氨酸和脯氨酸在植物休眠解除中起著重要作用。進(jìn)一步分析表明，與同一時(shí)期的對(duì)照組相比，參與精氨酸生物合成的大多數(shù)基因和代謝產(chǎn)物在三個(gè)階段中均下調(diào)，這可能是因?yàn)楦�氨酸在這兩個(gè)階段沒(méi)有保持高水平以促進(jìn)芽伸長(zhǎng)。因此，我們認(rèn)為脯氨酸顯著增加了上胚軸芽的伸長(zhǎng)，在上胚軸休眠的釋放起著重要作用。

玉米素是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的植物天然細(xì)胞分裂素，我們分析了玉米素生物合成途徑的基因和代謝產(chǎn)物的表達(dá)模式�？傮w而言，在前7天，參與玉米素合成途徑的基因和代謝物普遍增加，28天后，相關(guān)基因和代謝物總體減少，并做了轉(zhuǎn)錄組信息驗(yàn)證（圖4B–G）。
 

圖4. 生物合成途徑的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析。(A)DEG和DEMs在不同階段參與類黃酮生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝以及玉米素生物合成途徑。從藍(lán)色到黃色再到紅色的顏色梯度，代表基因的低、中、高FPKM。從紫色到黃色再到紅色的顏色梯度代表代謝物的低、中、高相對(duì)豐度。T：處理組；C：對(duì)照組。(B–G)通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組中的相關(guān)基因。IPT：異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；CYP735A：細(xì)胞分裂素羥化酶基因；CKX：細(xì)胞分裂素降解酶基因；CHS：查爾酮合成酶基因；C4H：肉桂酸-4-羥化酶；DFR：二氫黃酮醇-4-還原酶；“*”表示差異顯著，“**”表示差異非常顯著。

4.2、黃精種子上胚軸休眠解除過(guò)程中植物激素途徑的基因和代謝產(chǎn)物變化（圖5）

植物激素在植物休眠解除過(guò)程中起著重要作用，其中較為重要的是吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)和細(xì)胞分裂素(CTK)。

作者對(duì)植物激素途徑中的DEGs進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后富集在GA、ABA和IAA代謝途徑中。本次研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，表明上胚軸芽的伸長(zhǎng)在黃精種子休眠解除中的關(guān)鍵作用；屬于CTK的玉米素生物合成途徑在黃精種子的上胚軸休眠解除中也發(fā)揮了重要作用。
 

圖5. 轉(zhuǎn)錄組中GA、ABA和IAA生物合成、失活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)模式。(A)與GA途徑相關(guān)的基因表達(dá)熱圖。(B)與ABA途徑相關(guān)的基因表達(dá)熱圖。(C)IAA通路相關(guān)基因表達(dá)熱圖。從藍(lán)色到白色再到紅色的顏色梯度代表基因的低、中、高表達(dá)。Log2(FC)的范圍為–1到1。

4.3、類黃酮生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝以及玉米素生物合成途徑的關(guān)聯(lián)分析（圖6）
依據(jù)作者先前的結(jié)果，我們?cè)赥2和C2的三個(gè)途徑中對(duì)DEG和DEMs進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析（圖6）。我們發(fā)現(xiàn)精氨酸和脯氨酸代謝途徑中的部分代謝物與大多數(shù)基因顯著相關(guān)。此外，在CTK生物合成途徑中，參與黃精細(xì)胞分裂素脫氫酶基因(PcCKXs)在三個(gè)階段都是活躍的，并與類黃酮、精氨酸和脯氨酸代謝途徑代謝產(chǎn)物顯著相關(guān)，其可能也影響黃精種子的休眠解除。
 

圖6. 類黃酮生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝以及玉米素生物合成途徑的相關(guān)分析。注：橙色方框代表基因，藍(lán)色方框代表代謝物，粉色方框代表PcCKX。紅線表示正相關(guān)，藍(lán)線表示負(fù)相關(guān)。

4.4、黃精種子上胚軸休眠解除關(guān)鍵時(shí)期基因與代謝途徑變化模型分析

作者依據(jù)多組學(xué)分析結(jié)果構(gòu)建模型（圖7），得到外源6-BA處理促進(jìn)GA生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并誘導(dǎo)黃精種子上胚軸休眠的釋放。同時(shí)，外源6-BA處理可通過(guò)抑制PcCKXs的表達(dá)，增加上胚軸芽伸長(zhǎng)過(guò)程中內(nèi)源性細(xì)胞分裂激素的含量。未來(lái)的研究將集中于這些關(guān)鍵因素在黃精種子休眠解除中的功能作用。
 

圖7. 黃精種子上胚軸休眠解除關(guān)鍵時(shí)期代謝途徑變化示意圖模型。

結(jié)論
已有研究證實(shí)外源GA3可以緩解種子休眠，但不能緩解黃精種子的上胚軸休眠。在本研究中，作者探討了外源6-BA處理對(duì)黃精種子上胚軸休眠解除的分子機(jī)制。結(jié)果表明，外源6BA處理能顯著延長(zhǎng)上胚軸的芽長(zhǎng)，提高黃精種子的出苗率。在黃精種子上胚軸休眠解除過(guò)程中，處理組的玉米素、脯氨酸、生長(zhǎng)素和赤霉素含量較高，而類黃酮和精氨酸含量較低。PcCKXs與類黃酮生物合成代謝物以及精氨酸和脯氨酸代謝物具有顯著相關(guān)性，這些結(jié)果為外源6-BA解除黃精種子上胚軸休眠的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。