設(shè)置重復(fù)樣本的重要意義：測序無法消除個體間基因表達(dá)水平的差異
二代測序及基因芯片技術(shù)使得過去的十多年涌現(xiàn)出大量關(guān)于RNA-seq的研究。但似乎一些研究人員沒有注意到，基因表達(dá)的異質(zhì)性不僅僅是由技術(shù)誤差導(dǎo)致的。基因表達(dá)是一個相對隨機(jī)的過程，同一類型樣本中的不同個體，基因的表達(dá)可能會不一樣。一般來說，基因表達(dá)的異質(zhì)性（Var(Expr)）可以被分解為以下三個部分：
Var(Expr) = Across Group Variability + Measurement Error + Biological Variability
Across Group Variability即由于不同的處理或不同的細(xì)胞類型等導(dǎo)致的表達(dá)水平差異，即通常所說的組間差異。例如，腫瘤樣本與正常樣本之間的表達(dá)差異。
Measurement Error指實(shí)驗(yàn)或測序過程中的技術(shù)誤差。技術(shù)誤差會導(dǎo)致一定的基因表達(dá)異質(zhì)性，但其可以通過對同一樣本進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)/測序（即技術(shù)重復(fù)）來消除。
Biological Variability指同一分組的不同樣本之間的表達(dá)差異。即使排除掉Measurement Error，這種樣本間的表達(dá)差異也是存在的，即無法通過測序來消除Biological Variability。
在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，如果關(guān)注的是組間差異（Across Group Variability），那么Measurement Error和Biological Variability就會成為影響分析結(jié)果的因素。
Measurement Error可以通過技術(shù)重復(fù)來消除，我們下面主要關(guān)注一下Biological Variability為何不能通過測序來消除。
以下利用兩個研究的數(shù)據(jù)，評估了不同測量方法（二代測序和基因芯片）導(dǎo)致的表達(dá)水平差異：
說明：
每個點(diǎn)表示一個基因；
橫坐標(biāo)表示利用基因芯片方法檢測得到的某個基因在不同樣本之間的表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)差；
縱坐標(biāo)表示利用二代測序方法檢測得到的某個基因在不同樣本之間的表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)差；
黑色線表示對表達(dá)異質(zhì)性（s.d.）的最佳線性擬合；
紅色線表示y=x。
高亮的兩個點(diǎn)/三角表示基因COX4NB和RASGRP1。
從上述結(jié)果可以看到，兩種技術(shù)檢測得到的表達(dá)抑制性相差很小。
以下展示了不同樣本的兩個基因（COX4NB和RASGRP1）的標(biāo)準(zhǔn)化（圓：均值歸一化；三角：中心化）后的表達(dá)量。上圖表示二代測序，下圖表示基因芯片。
從結(jié)果可見，無論使用哪種技術(shù)，基因COX4NB在不同樣本中的表達(dá)水平都較為一致，基因RASGRP1則異質(zhì)性較高。
綜合上述兩個結(jié)果，Biological Variability是基因的特性，而與檢測方法無關(guān)。
Biological Variability對于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析影響很大�？紤]上述基因COX4NB和RASGRP1，如果檢測到不同處理組之間COX4NB的表達(dá)有差異，那么這個差異很可能是真陽性，因?yàn)榻M內(nèi)異質(zhì)性很��；但如果檢測到兩組之間RASGRP1表達(dá)有差異，如果重復(fù)樣本數(shù)量不夠，很有可能檢測到的差異是假陽性，因?yàn)闊o法排除是否是Biological Variability導(dǎo)致的。
綜上所述，為了得到更可信的結(jié)果，需要足夠的生物學(xué)重復(fù)。
Var(Expr) = Across Group Variability + Measurement Error + Biological Variability
Across Group Variability即由于不同的處理或不同的細(xì)胞類型等導(dǎo)致的表達(dá)水平差異，即通常所說的組間差異。例如，腫瘤樣本與正常樣本之間的表達(dá)差異。
Measurement Error指實(shí)驗(yàn)或測序過程中的技術(shù)誤差。技術(shù)誤差會導(dǎo)致一定的基因表達(dá)異質(zhì)性，但其可以通過對同一樣本進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)/測序（即技術(shù)重復(fù)）來消除。
Biological Variability指同一分組的不同樣本之間的表達(dá)差異。即使排除掉Measurement Error，這種樣本間的表達(dá)差異也是存在的，即無法通過測序來消除Biological Variability。
在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，如果關(guān)注的是組間差異（Across Group Variability），那么Measurement Error和Biological Variability就會成為影響分析結(jié)果的因素。
Measurement Error可以通過技術(shù)重復(fù)來消除，我們下面主要關(guān)注一下Biological Variability為何不能通過測序來消除。
以下利用兩個研究的數(shù)據(jù)，評估了不同測量方法（二代測序和基因芯片）導(dǎo)致的表達(dá)水平差異：
說明：
每個點(diǎn)表示一個基因；
橫坐標(biāo)表示利用基因芯片方法檢測得到的某個基因在不同樣本之間的表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)差；
縱坐標(biāo)表示利用二代測序方法檢測得到的某個基因在不同樣本之間的表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)差；
黑色線表示對表達(dá)異質(zhì)性（s.d.）的最佳線性擬合；
紅色線表示y=x。
高亮的兩個點(diǎn)/三角表示基因COX4NB和RASGRP1。
從上述結(jié)果可以看到，兩種技術(shù)檢測得到的表達(dá)抑制性相差很小。
以下展示了不同樣本的兩個基因（COX4NB和RASGRP1）的標(biāo)準(zhǔn)化（圓：均值歸一化；三角：中心化）后的表達(dá)量。上圖表示二代測序，下圖表示基因芯片。
從結(jié)果可見，無論使用哪種技術(shù)，基因COX4NB在不同樣本中的表達(dá)水平都較為一致，基因RASGRP1則異質(zhì)性較高。
綜合上述兩個結(jié)果，Biological Variability是基因的特性，而與檢測方法無關(guān)。
Biological Variability對于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析影響很大�？紤]上述基因COX4NB和RASGRP1，如果檢測到不同處理組之間COX4NB的表達(dá)有差異，那么這個差異很可能是真陽性，因?yàn)榻M內(nèi)異質(zhì)性很��；但如果檢測到兩組之間RASGRP1表達(dá)有差異，如果重復(fù)樣本數(shù)量不夠，很有可能檢測到的差異是假陽性，因?yàn)闊o法排除是否是Biological Variability導(dǎo)致的。
綜上所述，為了得到更可信的結(jié)果，需要足夠的生物學(xué)重復(fù)。
標(biāo)簽：
二代測序
- 空間和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)綜合分析揭示與不良預(yù)后相關(guān)的中間癌細(xì)胞群
- 單細(xì)胞測序助力揭示右心室容量超荷會通過免疫反應(yīng)重啟心肌細(xì)胞的增殖
- BS+ChIP-seq在揭示DNA甲基化調(diào)控非編碼RNA抑制腫瘤侵襲性中的應(yīng)用
- 靶基因甲基化測序(Target-BS)等在揭示特應(yīng)性皮炎新發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
- ChIP等揭示糖皮質(zhì)激素和TET2共調(diào)控促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的表觀遺傳機(jī)制
- 游離細(xì)胞DNA（cfDNA）檢測整體研究方案及其應(yīng)用案例
- DNA甲基化修飾整體研究方案技術(shù)介紹及經(jīng)典案例分析
- DNA甲基化詳解
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