每年，全球大約有5000萬人患上膿毒癥，其中死亡人數(shù)超過20%。膿毒癥是一種由感染引發(fā)的疾病，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致一個或多個器官功能衰竭。孕產(chǎn)婦膿毒癥可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括先兆子癇和早產(chǎn)，在英國被認(rèn)為是孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一。

妊娠期間發(fā)生的生理變化容易導(dǎo)致膿毒癥惡化，并帶來較高的死亡風(fēng)險(xiǎn)。然而，造成死亡率增加的機(jī)制尚不清楚，也缺乏相關(guān)的治療方法。若能深入了解膿毒癥婦女全身免疫紊亂的機(jī)制，也許能揭示一些治療方法，改善孕產(chǎn)婦及新生兒的健康。

近日，南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院的龔神海團(tuán)隊(duì)在妊娠期膿毒癥易感機(jī)制研究方面取得進(jìn)展。研究者發(fā)現(xiàn)，妊娠引起的腸道菌群變化會驅(qū)動巨噬細(xì)胞焦亡，并加劇化膿性炎癥。這項(xiàng)研究成果發(fā)表在《Immunity》雜志上，中醫(yī)藥學(xué)院龔神海副教授、肖煒研究員和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院姜勇教授為本文通訊作者。
 

圖片來源：《Immunity》
（https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.01.015）

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了兩種膿毒癥小鼠模型：盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）和脂多糖（LPS）誘導(dǎo)模型，其中使用的無菌雌性小鼠是由賽業(yè)生物提供的。研究者用廣譜抗生素ABX來清除小鼠的腸道菌群，然后開展腸道菌群移植。在分析腸道菌群變化時(shí)研究者采用了多組學(xué)分析，還通過免疫沉淀等分析確定了FMN的互作對象和作用機(jī)制。

技術(shù)路線
01 通過腸道菌群移植確定膿毒癥的易感性增加與腸道菌群有關(guān)
02 通過綜合多組學(xué)分析確定糞副擬桿菌及其產(chǎn)物FMN對膿毒癥小鼠有保護(hù)作用
03 FMN可抑制膿毒癥小鼠的巨噬細(xì)胞焦亡
04 FMN直接與hnRNPUL2相互作用，阻止其與Nlrp3啟動子序列結(jié)合

研究結(jié)果
1.膿毒癥的易感性增加與腸道菌群有關(guān)
為了分析妊娠是否會增加對膿毒癥的易感性，研究人員采用了多種模型。在盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）小鼠模型中，與非懷孕組相比，懷孕組在CLP后的死亡率大幅增加。LPS處理的小鼠也出現(xiàn)了類似的結(jié)果。組織病理學(xué)檢查顯示，接受CLP的懷孕小鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的多器官損傷和細(xì)胞死亡。同時(shí)，妊娠會增加CLP誘導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)，并抑制病原體清除能力，從而增加對膿毒癥誘導(dǎo)的多器官衰竭的易感性。

腸道菌群參與了膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，其組成在妊娠期間被重塑。因此，研究人員假設(shè)孕產(chǎn)婦膿毒癥的高死亡率與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。通過抗生素處理和腸道菌群移植 FMT。研究者發(fā)現(xiàn)接受懷孕供體腸道菌群的小鼠有更高的血清ALT活性，且CLP后血漿中的細(xì)胞因子濃度也高于對照小鼠。懷孕供體的腸道菌群移植增加了膿毒癥小鼠血液和腹腔灌洗液中的細(xì)菌載量。這些結(jié)果表明，妊娠期間腸道微生物組的變化足以驅(qū)動膿毒癥進(jìn)展。

2.糞副擬桿菌或FMN對膿毒癥小鼠有保護(hù)作用
接下來，研究者便深入剖析了妊娠期間腸道菌群的變化如何導(dǎo)致膿毒癥的易感性增加。16S rRNA基因測序的結(jié)果顯示，懷孕組和非懷孕組的腸道菌群存在明顯的組間分離。線性判別分析表明，懷孕婦女和小鼠的共同點(diǎn)是腸道副擬桿菌屬（Parabacteroides merdae）豐度下降。同時(shí)，與非懷孕小鼠相比，懷孕小鼠體內(nèi)的芒柄花素（FMN）水平較低（圖1），F(xiàn)MN屬于異黃酮類化合物，具有抗炎作用。通過綜合多組學(xué)分析，研究者進(jìn)一步證實(shí)了副擬桿菌與FMN豐度之間的相關(guān)性。而且在懷孕婦女和小鼠中，下降的是糞副擬桿菌，而不是其他物種。
 

副擬桿菌(P. merdae) 豐度和芒柄花素（FMN）在妊娠期間下降^[1]

對糞副擬桿菌進(jìn)行全基因組測序后，研究者發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌的基因組包含13個開放閱讀框，編碼不同的β-半乳糖苷酶家族成員。腸道中的β-半乳糖苷酶可水解食物中的活性化合物，生成高活性的異黃酮類化合物（包括FMN）。研究者發(fā)現(xiàn)，利用糞副擬桿菌預(yù)處理膿毒癥小鼠后，小鼠腹腔灌洗液中的FMN濃度增加。妊娠期間隨著糞副擬桿菌的減少，膿毒癥小鼠腹腔內(nèi)的FMN濃度也下降，表明糞副擬桿菌通過減少FMN的生成而參與膿毒癥的進(jìn)展。

為了明確糞副擬桿菌在膿毒癥中的作用，研究人員用糞副擬桿菌對膿毒癥小鼠進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)小鼠血漿和腹腔灌洗液中的TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子下降，且小鼠生存率提高。同樣地，F(xiàn)MN處理也減少了膿毒癥小鼠腹腔和血液中的細(xì)菌量，提高了小鼠的生存率。這些數(shù)據(jù)表明，糞副擬桿菌或FMN的注射可以減少炎癥反應(yīng)，對膿毒癥小鼠有保護(hù)作用。

3.FMN抑制了巨噬細(xì)胞焦亡
研究人員猜測，妊娠通過破壞正常的免疫功能而加重了膿毒癥。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者對膿毒癥小鼠腹腔灌洗液中的免疫細(xì)胞進(jìn)行定量。懷孕小鼠接受CLP或LPS處理后，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量減少。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞的耗竭會加劇膿毒癥小鼠的多器官功能衰竭，而糞副擬桿菌和FMN注射都能增加小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞數(shù)量。因此，F(xiàn)MN通過抑制免疫功能失調(diào)來促進(jìn)細(xì)菌清除，從而降低膿毒癥小鼠的死亡率。

不過，這背后的具體機(jī)制是什么？以往的研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥發(fā)生時(shí)腹膜巨噬細(xì)胞會發(fā)生焦亡。因此，研究者提出，懷孕膿毒癥小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的減少是因?yàn)榻雇�。FMN的注射抑制了LPS加ATP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡，伴隨著caspase-1 p20和GSDMD-N產(chǎn)生和LDH釋放的減少。在經(jīng)過LPS加ATP處理的BMDM中，F(xiàn)MN還減少了Nlrp3 mRNA轉(zhuǎn)錄本以及IL-1β和IL-18的釋放（圖2）。

圖2 FMN抑制了巨噬細(xì)胞焦亡^[1]

蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，在LPS加ATP處理的BMDM中，RNA結(jié)合蛋白hnRNPUL2是FMN注射后降幅最大的蛋白質(zhì)。通過RNA干擾分析，研究者發(fā)現(xiàn)hnRNPUL2的沉默可以減少BMDM的細(xì)胞焦亡。在hnRNPUL2-siRNA處理的BMDM中，F(xiàn)MN對焦亡的抑制作用減弱，表明FMN以hnRNPUL2依賴性的方式阻止巨噬細(xì)胞焦亡。通過免疫沉淀等分析，研究者發(fā)現(xiàn)FMN直接與hnRNPUL2相互作用，引發(fā)BMDM的溶酶體降解，從而導(dǎo)致hnRNPUL2在細(xì)胞核的積累減少，最終阻止其與Nlrp3啟動子序列的結(jié)合，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞焦亡。

最后，研究人員評估了hnRNPUL2在CLP誘導(dǎo)的膿毒癥中的作用。hnRNPUL2的基因沉默改善了CLP小鼠的存活率并減弱了多器官功能衰竭。此外，膿毒癥患者腸道內(nèi)的糞副擬桿菌和FMN豐度與病情發(fā)展呈負(fù)相關(guān)。至此，研究者揭示了FMN-hnRNPUL2-NLRP3軸在妊娠期膿毒癥中的重要性。

研究結(jié)論

妊娠期腸道微生物紊亂驅(qū)動膿毒癥期間巨噬細(xì)胞死亡的分子機(jī)制^[1]

總的來說，這項(xiàng)研究顯示了妊娠期間的腸道菌群失調(diào)如何通過促進(jìn)hnRNPUL2與Nlrp3啟動子區(qū)域的相互作用來引發(fā)caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，從而增加了膿毒癥易感性（圖3），這為開發(fā)膿毒癥的新型治療策略提供了思路。

原文檢索：
[1] Chen X, Wu R, Li L, et al. Pregnancy-induced changes to the gut microbiota drive macrophage pyroptosis and exacerbate septic inflammation. Immunity. 2023 Feb 14;56(2):336-352.e9. doi: 10.1016/j.immuni.2023.01.015.  PMID: 36792573.