文章標(biāo)題：Qing-Chang-Hua-Shi granule ameliorates DSS-induced colitis by activating NLRP6 signaling and regulating Th17/Treg balance
發(fā)表期刊：Phytomedicine
影響因子：6.656
作者單位：江蘇省中醫(yī)院
百趣提供服務(wù)：中藥非靶標(biāo)代謝組學(xué)

研究背景
作為一種炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)，潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)常見于30-40歲的成年人，以腹痛、血性腹瀉和里急后重為特征。代謝組學(xué)分享，5-氨基水楊酸(5-Aminosalicylic acid, 5-ASA)類、糖皮質(zhì)激素類、生物制劑和免疫調(diào)節(jié)劑是UC的主要藥物。盡管具有一定的治療效果，但由于其副作用和高成本，這些藥物的使用受到限制。因此，開發(fā)具有低不良反應(yīng)率的替代治療劑治療UC勢在必行。

輔助性T細(xì)胞17(T helper 17, Th17)的分泌物能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在IBD患者的結(jié)腸粘膜中Th17細(xì)胞數(shù)增加。代謝組學(xué)分享，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T, Treg)具有維持免疫穩(wěn)態(tài)的能力。IBD患者和患UC小鼠的Treg數(shù)均降低，UC的發(fā)生和發(fā)展受到Th17和Treg細(xì)胞之間不平衡的顯著影響。

NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域6(NOD-like receptor family pyrin domain containing 6, NLRP6)在腸道和肝臟中具有高水平的表達(dá)，并在調(diào)節(jié)炎癥，維持上皮完整性和調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用。NLRP6在腸道細(xì)胞內(nèi)募集ACS（Adaptor Apoptosis-associated Speck，一類蛋白，在癥狀嚴(yán)重的炎癥部位中性粒細(xì)胞中ASC表達(dá)增多）形成炎癥小體，最終與Caspase-1聚合共同參與促使IL-1β和IL-18（二者都屬于白介素）成熟。代謝組學(xué)分享，IL-1β和IL-18對于炎癥的調(diào)節(jié)起著重要的作用，與正常小鼠相比，NLRP6缺失的小鼠DSS誘導(dǎo)后表現(xiàn)出更嚴(yán)重的結(jié)腸炎癥，同時(shí)IL-18水平降低。IL-18還能夠維持結(jié)腸中的腸屏障完整性。IL-1β通過激活I(lǐng)L-1受體(IL-1R)信號傳導(dǎo)促進(jìn)Th17細(xì)胞分化和膨大。因此，預(yù)計(jì)NLRP6信號傳導(dǎo)可能成為UC治療的新靶點(diǎn)。

中藥清腸化濕顆粒（以下簡稱為：QCHS）在中國廣泛用于治療潰瘍性結(jié)腸炎。本文作者先前的研究證實(shí)QCHS顆粒和QCHS的多種中藥成分在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型中的藥理活性。代謝組學(xué)分享，然而，QCHS的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)有待進(jìn)一步探索。本次研究就旨在評估QCHS對結(jié)腸炎的治療效果并揭示其作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)方法
在進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)之前，使用UHPLC-QTOF-MS法對QCHS提取物中的有效成分進(jìn)行了定性分析（由百趣生物提供）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)流程如下：
 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.QCHS顆粒草藥成分的UHPLC-QTOF-MS分析結(jié)果
正、負(fù)模式下QCHS提取液的總離子色譜圖(TIC)如圖1所示，鑒定了每種草藥的代表性化合物質(zhì)譜峰位置被標(biāo)記在圖上并列于表2。

圖1. 通過UHPLC-QTOF-MS分析QCHS的正(A)負(fù)(B)模式下總離子色譜圖(TIC)

表2. QCHS中生物活性化合物的化學(xué)特性

2.QCHS能減輕小鼠DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎
作者通過建立DSS誘導(dǎo)的UC模型以評估QCHS的作用（圖2A）。DSS處理7天后，與對照組相比，模型組體重減輕，疾病活動指數(shù)(DAI)增加，結(jié)腸長度縮短，而QCHS和5-ASA治療顯著減輕了DSS誘導(dǎo)的UC癥狀（圖2B–E）。代謝組學(xué)分享，H＆E染色評估UC小鼠的病理損傷結(jié)果：DSS組結(jié)腸有隱窩丟失，炎性細(xì)胞浸潤和明顯的粘膜損傷。然而，QCHS和5-ASA明顯緩解了結(jié)腸組織的病理狀態(tài)（圖2F）。總的來說，結(jié)果表明QCHS治療改善了DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的病理體征，高劑量QCHS的治療效果優(yōu)于5-ASA（圖2B-F）。
 

圖2. QCHS治療減輕了DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎

3.QCHS治療能抑制UC小鼠的結(jié)腸炎癥反應(yīng)
作者檢測了血清中經(jīng)典促炎細(xì)胞因子的水平。DSS給藥可顯著提高IL-6，IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平，而QCHS治療后可顯著降低三者的水平（圖3A-C）。代謝組學(xué)分享，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子-κB(NF-κB)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，數(shù)據(jù)表明QCHS治療降低了MAPK（JNK，ERK和p38）(D)和NF-κB途徑的核心分子：IKKα/β，IκBα和p65的磷酸化水平(E)。上述結(jié)果表明QCHS顯著抑制了DSS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

圖3. QCHS抑制UC小鼠結(jié)腸組織的炎癥反應(yīng)

4 QCHS促進(jìn)UC小鼠的粘膜完整性
如圖所示，DSS誘導(dǎo)后杯狀細(xì)胞的數(shù)量和粘蛋白產(chǎn)生的減少，但在QCHS處理后顯著增加（圖4A）。代謝組學(xué)分享，Claudin-5和粘蛋白2(Muc2)是維持腸屏障完整性的關(guān)鍵成分，從mRNA和蛋白質(zhì)水平(B-D)來看，QCHS處理后兩者都得到了改善。該數(shù)據(jù)表明，使用QCHS治療可以增強(qiáng)UC小鼠的粘膜完整性。
 

圖4. QCHS改善UC小鼠腸粘膜的完整性

5.QCHS維持UC小鼠Th17/Treg的平衡
如圖5A所示，QCHS處理后UC小鼠MLN中Th17的水平降低，同時(shí)Tregs的比例顯著增加（圖5B）。代謝組學(xué)分享，QCHS使Th17-特異性轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子（RORγt，IL-17和IL-22）下調(diào)（圖5C），而Treg的mRNA水平表征轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白P3（Foxp3），細(xì)胞因子IL-10和TGF-β上調(diào)（圖5D）。Western blot分析結(jié)果表明在蛋白質(zhì)水平也有相同的趨勢（圖5E）。因此，QCHS重新調(diào)整了Th17和Tregs的平衡，以維持UC小鼠腸道免疫的穩(wěn)態(tài)。
 

圖5. QCHS糾正了UC小鼠的Th17/Treg失衡

6.NLRP6信號傳導(dǎo)參與QCHS對UC小鼠的治療作用
許多研究報(bào)道NLRP6在調(diào)節(jié)結(jié)腸炎和Th17分化中具有重要功能。檢測NLRP6炎性體信號通路的激活情況，結(jié)果顯示NLRP6在正常小鼠中高表達(dá)，但在DSS給藥后顯著降低，隨后通過QCHS處理，這種趨勢發(fā)生逆轉(zhuǎn)（圖6A）。代謝組學(xué)分享，DSS給藥后，小鼠結(jié)腸組織中核心炎性體成分NLRP6，ASC和IL-18的mRNA水平降低，但QCHS治療后顯著升高（圖6B-D）；DSS處理后Caspase-1的表達(dá)增加，又經(jīng)QCHS處理后其表達(dá)明顯降低（圖6E）。Western blot結(jié)果表明，QCHS激活NLRP6和ASC的表達(dá)，同時(shí)調(diào)節(jié)IL-1β和IL-18的成熟（圖6F），結(jié)果表明QCHS可能對體內(nèi)NLRP6信號傳導(dǎo)具有調(diào)節(jié)作用。
 

圖6. QCHS促進(jìn)體內(nèi)NLRP6炎性體信號傳導(dǎo)途徑的激活
 

7.QCHS在體外抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥并激活NLRP6信號傳導(dǎo)
作者通過用LPS（1μg/ml）建立細(xì)胞炎癥模型，評估含QCHS血清的作用。結(jié)果使用含QCHS的血清處理后顯著降低了IL-6、IL-1β和TNF-α的相對水平（圖7B-D）。代謝組學(xué)分享，同樣，NLRP6炎癥小體信號通路的主要分子NLRP6、IL-18和ASC在LPS刺激下降低，但在含QCHS的血清處理后顯著升高（圖7E-G）。Western blot分析條帶的結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也相似（圖7I）。這些結(jié)果顯示，含QCHS的血清影響了體外炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與NLRP6通路有關(guān)。
 

圖7. 含有QCHS的血清抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥并激活NCM-460細(xì)胞中的NLRP6信號傳導(dǎo)途徑

為了揭示NLRP6是否是QCHS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的功能靶標(biāo)，使用轉(zhuǎn)染NLRP6小干擾RNA（siNLRP6）以干擾正常人腸上皮細(xì)胞系NCM-460中NLRP6的表達(dá)。結(jié)果表明，阻斷NLRP6信號傳導(dǎo)可能導(dǎo)致QCHS的炎癥調(diào)節(jié)作用的消除（圖8）。因此，可以認(rèn)為QCHS的治療效果與NLRP6的激活有關(guān)。
 

圖8. NLRP6干擾消除了QCHS介導(dǎo)的細(xì)胞炎癥調(diào)節(jié)
 

討論與總結(jié)
在正常狀態(tài)下，Th17細(xì)胞分泌特定的炎性細(xì)胞因子以維持宿主免疫，而Tregs抑制Th17的過度激活以保持平衡的免疫功能。Th17異常升高或Treg功能缺陷可能導(dǎo)致UC的發(fā)展。代謝組學(xué)分享，因此，靶向調(diào)節(jié)Th17/Treg是治療UC的有效方法，植物藥物是潛在的治療劑。IL-18和IL-1β的成熟直接依賴于NLRP6的激活。因此，NLRP6信號有望成為UC的新靶點(diǎn)。

然而，目前的藥物仍然主要用于維持或誘導(dǎo)緩解，由于這些藥物的缺陷，UC患者仍然面臨“治療上限”。代謝組學(xué)分享，有積極跡象表明，中藥在治療UC方面具有潛在的治療能力。在中國的一項(xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)中，QCHS已被臨床證明對活動期UC有效且安全。

本次研究中報(bào)道了QCHS的治療效果，并揭示了QCHS在UC小鼠中的可能機(jī)制。QCHS治療減輕了UC的癥狀，表現(xiàn)為體重和結(jié)腸長度的恢復(fù)，DAI指數(shù)降低，粘膜損傷減輕。此外，與5-ASA相比，高劑量QCHS顯示出優(yōu)異的治療效果。QCHS治療還抑制了過度的炎癥反應(yīng)，在UC小鼠中保持結(jié)腸的粘膜完整性有助于UC小鼠結(jié)腸粘膜的深度愈合。最重要的是，本研究探索了QCHS的免疫調(diào)節(jié)功能。QCHS重新平衡了Th17/Treg的水平，從而保護(hù)小鼠免受結(jié)腸炎。從機(jī)制上講，NLRP6炎性體信號通路參與QCHS介導(dǎo)的UC保護(hù)（圖9）。代謝組學(xué)分享，QCHS顯著激活NLRP6的表達(dá)并調(diào)節(jié)IL-1β和IL-18的成熟，因此發(fā)揮抗炎作用。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)表明，QCHS的功能依賴于NLRP6的激活。
 

圖9. QCHS免疫調(diào)節(jié)和結(jié)腸保護(hù)作用的圖形摘要

綜上所述，QCHS對UC的臨床治療效果是肯定的，但其作用機(jī)制仍不清楚。代謝組學(xué)分享，本次研究結(jié)果探索了QCHS的可能靶點(diǎn)，為QCHS的抗炎和免疫保護(hù)作用提供了證據(jù)，并可能為其作為UC替代治療策略的發(fā)展提供機(jī)制基礎(chǔ)。