宮頸癌體外模型中CCL22極化TAMs 到 M2a巨噬細胞
宮頸癌是全球女性癌癥死亡的第四大原因，也是第三大常見癌癥。目前，免疫療法是宮頸癌治療的突破性進展。然而，總緩解率較低。因此，進一步確定新的免疫檢查點的努力至關重要。
根據(jù)活化狀態(tài)和發(fā)揮功能的不同，巨噬細胞主要可分為M1型即經(jīng)典活化的巨噬細胞和M2型即替代性活化的巨噬細胞。最近，研究描述了M2巨噬細胞的三種不同亞型（M2a，M2b和M2c）。M2a巨噬細胞被IL-4極化，在組織重塑和減輕炎癥中起作用。M2亞型在腫瘤中起作用，M2a協(xié)同促進遷移性和侵襲性乳腺癌細胞反應。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs），包括M1和M2型巨噬細胞，靶向TAMs，能夠有效抑制腫瘤的生長和轉移，因此，TAMs 是具有潛力的抗腫瘤靶標。TAMs可以通過直接參與T細胞抑制和凋亡受體來抑制T細胞功能。然而，一些研究表明，TAMs的Fc γ受體參與抗體依賴性細胞毒性。因此，TAMs的清除會阻斷效應T細胞的反應，導致藥物作用降低。將促腫瘤的TAMs調(diào)控為抗腫瘤類型是研究的重要焦點。
C-C基序趨化因子配體22（CCL22）作為一種分泌蛋白，參與各種免疫細胞的趨化活性，包括單核細胞和活化的T淋巴細胞。CCL22已被證明在腫瘤促進中起作用。M2巨噬細胞中表達的大量CCL22使結直腸癌對化療具有耐藥性。此外，CCL22的mRNA在宮頸癌組織中的表達高于正常宮頸組織中的mRNA。已經(jīng)證明，CCL22與宮頸癌預后相關。然而，CCL22促進宮頸癌進展的機制尚不清楚。
在德國慕尼黑大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科、心臟病科、病理科以及奧格斯堡大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科的一項聯(lián)合研究中，構建了體外共培養(yǎng)體系以形成TAMs，通過流式細胞術評估了CCL22對M2a標志物CD206表達的影響，并揭示了CCL22可能是宮頸癌的治療靶點，這可能是由于其在調(diào)節(jié)巨噬細胞極化中的作用。
CCL22在宮頸癌體外TAMs中的表達
為了確定體外宮頸癌中CCL22 mRNA水平，實驗量化了其在TAMs，M1，M2a，M2b和M2c巨噬細胞中的表達。為了獲得TAMs，將宮頸癌細胞與M0巨噬細胞共培養(yǎng)48小時。結果表明，與HeLa或Siha細胞（人宮頸癌細胞）共培養(yǎng)的TAMs中CCL22的mRNA水平顯著高于M1巨噬細胞。應該注意的是，雖然無顯著性差異，但CCL22的mRNA水平在TAMs中表現(xiàn)出高于M2b和M2c巨噬細胞的趨勢，而在M2a巨噬細胞中較低。此外，單獨培養(yǎng)或與M0巨噬細胞共培養(yǎng)的宮頸癌細胞系中CCL22的mRNA水平極低（圖1）。這些結果表明，CCL22主要來源于宮頸癌微環(huán)境中的TAMs，而非宮頸癌細胞。
圖1 CCL22在宮頸癌體外TAMs中的表達。由極化的巨噬細胞（M1、M2a、M2b、M2c）、TAMs（腫瘤相關巨噬細胞，由與HeLa或Siha細胞共培養(yǎng)形成）、宮頸癌細胞HeLa、Siha、co-HeLa 和co-Siha（單獨和在共培養(yǎng)系統(tǒng)中）制備總RNA。使用CCL22特異性引物構建RT-PCR分析。
CD206++ 和 CD163++ 分別是 M2a 和 M2c 巨噬細胞的標志物
不同亞群的巨噬細胞中的表面分子不同，包括CD80，CD86，CD206，LIGHT（TNFSF14），TLR4和CD163。通過流式細胞術測試細胞表面分子的表達。將FMO樣品和未極化巨噬細胞M0分子的平均熒光強度（MFI）分別視為 marker+ 和marker++ 的臨界值。M1和M2b巨噬細胞的CD80++百分比明顯高于其他組（圖2 a、b）。M2a巨噬細胞的CD206++百分比明顯高于所有其他巨噬細胞亞型（圖2 c、d）。LIGHT未顯示顯著變化（圖2 e、f）。與所有其他巨噬細胞亞型相比，M2c巨噬細胞的CD163++ 含量顯著更高（圖2 g、h）。綜上所述，CD80++無法區(qū)分M1和M2b巨噬細胞，其中M2a巨噬細胞的標志物是CD206++，M2c巨噬細胞標志物是CD163++。
CCL22 可通過自分泌通路將宮頸癌中 TAMs 極化為的 M2a 巨噬細胞
如前所述，CCL22+ 細胞浸潤量較高可預測宮頸癌預后不良。正常宮頸組織局部免疫微環(huán)境中CCL22 mRNA水平低于宮頸癌組織。CCL22是M2a巨噬細胞的標志物。因此，有必要研究CCL22是否可能通過誘導M2a巨噬細胞的生成來促進腫瘤進展。為了驗證這一點，實驗通過轉染人CCL22特異性siRNA（si-CCL22）或陰性對照siRNA（sicon-CCL22）在M0細胞中進行RNA干擾。隨后，分別將處理后的M0細胞與HeLa和Siha細胞共培養(yǎng)。實時PCR分析證實了RNA干擾的效率（圖3 a）。si-CCL22 TAMs中 CCL22 mRNA的表達量為sicon-CCL22的17%。
從共培養(yǎng)的細胞中分離出共培養(yǎng)的sicon-CCL22 TAMs和共培養(yǎng)的si-CCL22 TAMs。接下來，通過流式細胞術檢測了siCCL22-TAMs與sicon-TAMs 的CD206的表達。如圖3 b-e，敲低CCL22表達顯著降低了與HeLa細胞和Siha細胞共培養(yǎng)的TAMs的CD206的MFI。這些數(shù)據(jù)表明，敲低CCL22可以阻止M2a巨噬細胞的極化。
CCL22載體的效率通過實時熒光定量PCR分析（圖3 f）。從共培養(yǎng)的細胞中分離出T-CCL22 TAMs中CCL22 mRNA的表達。接下來，通過流式細胞術檢測了T-CCL22-TAMs與con-TAMs 的CD206的表達。如圖3 G-J ，過表達的CCL22分別大大提高了與HeLa和Siha細胞共培養(yǎng)的TAMs中的CD206的MFI。這些數(shù)據(jù)表明，過表達的CCL22阻止了M2a巨噬細胞的極化。
這項研究表明，CCL22是從TAMs而不是宮頸癌細胞系分泌的。而且，在宮頸癌中，當巨噬細胞在含有人血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，CD206++ 是M2a巨噬細胞的標志物，CD163++是M2c巨噬細胞的標志物，CD80++ 是M1和M2b巨噬細胞的標志物。CCL22可以使宮頸癌中TAMs向M2a巨噬細胞極化。因此，CCL22可能是其治療的治療靶點。
參考文獻：Wang Q, Sudan K, Schmoeckel E, Kost BP, Kuhn C, Vattai A, Vilsmaier T, Mahner S, Jeschke U, Heidegger HH. CCL22-Polarized TAMs to M2a Macrophages in Cervical Cancer In Vitro Model. Cells. 2022 Jun 25;11(13):2027. doi: 10.3390/cells11132027. PMID: 35805111; PMCID: PMC9265611.
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯(lián)系小編修正。
微信搜索公眾號“Naturethink”，了解更多細胞體外仿生培養(yǎng)技術及應用。
根據(jù)活化狀態(tài)和發(fā)揮功能的不同，巨噬細胞主要可分為M1型即經(jīng)典活化的巨噬細胞和M2型即替代性活化的巨噬細胞。最近，研究描述了M2巨噬細胞的三種不同亞型（M2a，M2b和M2c）。M2a巨噬細胞被IL-4極化，在組織重塑和減輕炎癥中起作用。M2亞型在腫瘤中起作用，M2a協(xié)同促進遷移性和侵襲性乳腺癌細胞反應。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs），包括M1和M2型巨噬細胞，靶向TAMs，能夠有效抑制腫瘤的生長和轉移，因此，TAMs 是具有潛力的抗腫瘤靶標。TAMs可以通過直接參與T細胞抑制和凋亡受體來抑制T細胞功能。然而，一些研究表明，TAMs的Fc γ受體參與抗體依賴性細胞毒性。因此，TAMs的清除會阻斷效應T細胞的反應，導致藥物作用降低。將促腫瘤的TAMs調(diào)控為抗腫瘤類型是研究的重要焦點。
C-C基序趨化因子配體22（CCL22）作為一種分泌蛋白，參與各種免疫細胞的趨化活性，包括單核細胞和活化的T淋巴細胞。CCL22已被證明在腫瘤促進中起作用。M2巨噬細胞中表達的大量CCL22使結直腸癌對化療具有耐藥性。此外，CCL22的mRNA在宮頸癌組織中的表達高于正常宮頸組織中的mRNA。已經(jīng)證明，CCL22與宮頸癌預后相關。然而，CCL22促進宮頸癌進展的機制尚不清楚。
在德國慕尼黑大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科、心臟病科、病理科以及奧格斯堡大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科的一項聯(lián)合研究中，構建了體外共培養(yǎng)體系以形成TAMs，通過流式細胞術評估了CCL22對M2a標志物CD206表達的影響，并揭示了CCL22可能是宮頸癌的治療靶點，這可能是由于其在調(diào)節(jié)巨噬細胞極化中的作用。
CCL22在宮頸癌體外TAMs中的表達
為了確定體外宮頸癌中CCL22 mRNA水平，實驗量化了其在TAMs，M1，M2a，M2b和M2c巨噬細胞中的表達。為了獲得TAMs，將宮頸癌細胞與M0巨噬細胞共培養(yǎng)48小時。結果表明，與HeLa或Siha細胞（人宮頸癌細胞）共培養(yǎng)的TAMs中CCL22的mRNA水平顯著高于M1巨噬細胞。應該注意的是，雖然無顯著性差異，但CCL22的mRNA水平在TAMs中表現(xiàn)出高于M2b和M2c巨噬細胞的趨勢，而在M2a巨噬細胞中較低。此外，單獨培養(yǎng)或與M0巨噬細胞共培養(yǎng)的宮頸癌細胞系中CCL22的mRNA水平極低（圖1）。這些結果表明，CCL22主要來源于宮頸癌微環(huán)境中的TAMs，而非宮頸癌細胞。
CD206++ 和 CD163++ 分別是 M2a 和 M2c 巨噬細胞的標志物
不同亞群的巨噬細胞中的表面分子不同，包括CD80，CD86，CD206，LIGHT（TNFSF14），TLR4和CD163。通過流式細胞術測試細胞表面分子的表達。將FMO樣品和未極化巨噬細胞M0分子的平均熒光強度（MFI）分別視為 marker+ 和marker++ 的臨界值。M1和M2b巨噬細胞的CD80++百分比明顯高于其他組（圖2 a、b）。M2a巨噬細胞的CD206++百分比明顯高于所有其他巨噬細胞亞型（圖2 c、d）。LIGHT未顯示顯著變化（圖2 e、f）。與所有其他巨噬細胞亞型相比，M2c巨噬細胞的CD163++ 含量顯著更高（圖2 g、h）。綜上所述，CD80++無法區(qū)分M1和M2b巨噬細胞，其中M2a巨噬細胞的標志物是CD206++，M2c巨噬細胞標志物是CD163++。
圖2 CD206++和CD163++分別是M2a和M2c巨噬細胞的標志物。
CCL22 可通過自分泌通路將宮頸癌中 TAMs 極化為的 M2a 巨噬細胞
如前所述，CCL22+ 細胞浸潤量較高可預測宮頸癌預后不良。正常宮頸組織局部免疫微環(huán)境中CCL22 mRNA水平低于宮頸癌組織。CCL22是M2a巨噬細胞的標志物。因此，有必要研究CCL22是否可能通過誘導M2a巨噬細胞的生成來促進腫瘤進展。為了驗證這一點，實驗通過轉染人CCL22特異性siRNA（si-CCL22）或陰性對照siRNA（sicon-CCL22）在M0細胞中進行RNA干擾。隨后，分別將處理后的M0細胞與HeLa和Siha細胞共培養(yǎng)。實時PCR分析證實了RNA干擾的效率（圖3 a）。si-CCL22 TAMs中 CCL22 mRNA的表達量為sicon-CCL22的17%。
從共培養(yǎng)的細胞中分離出共培養(yǎng)的sicon-CCL22 TAMs和共培養(yǎng)的si-CCL22 TAMs。接下來，通過流式細胞術檢測了siCCL22-TAMs與sicon-TAMs 的CD206的表達。如圖3 b-e，敲低CCL22表達顯著降低了與HeLa細胞和Siha細胞共培養(yǎng)的TAMs的CD206的MFI。這些數(shù)據(jù)表明，敲低CCL22可以阻止M2a巨噬細胞的極化。
CCL22載體的效率通過實時熒光定量PCR分析（圖3 f）。從共培養(yǎng)的細胞中分離出T-CCL22 TAMs中CCL22 mRNA的表達。接下來，通過流式細胞術檢測了T-CCL22-TAMs與con-TAMs 的CD206的表達。如圖3 G-J ，過表達的CCL22分別大大提高了與HeLa和Siha細胞共培養(yǎng)的TAMs中的CD206的MFI。這些數(shù)據(jù)表明，過表達的CCL22阻止了M2a巨噬細胞的極化。
圖3 CCL22可以通過自分泌通路使宮頸癌中的TAMs極化為M2a巨噬細胞。
這項研究表明，CCL22是從TAMs而不是宮頸癌細胞系分泌的。而且，在宮頸癌中，當巨噬細胞在含有人血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，CD206++ 是M2a巨噬細胞的標志物，CD163++是M2c巨噬細胞的標志物，CD80++ 是M1和M2b巨噬細胞的標志物。CCL22可以使宮頸癌中TAMs向M2a巨噬細胞極化。因此，CCL22可能是其治療的治療靶點。
參考文獻：Wang Q, Sudan K, Schmoeckel E, Kost BP, Kuhn C, Vattai A, Vilsmaier T, Mahner S, Jeschke U, Heidegger HH. CCL22-Polarized TAMs to M2a Macrophages in Cervical Cancer In Vitro Model. Cells. 2022 Jun 25;11(13):2027. doi: 10.3390/cells11132027. PMID: 35805111; PMCID: PMC9265611.
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯(lián)系小編修正。
微信搜索公眾號“Naturethink”，了解更多細胞體外仿生培養(yǎng)技術及應用。
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com