文章標(biāo)題：Applying multi‐omics toward tumor microbiome research
發(fā)表期刊：iMeta

作者單位：俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院放射腫瘤學(xué)系、俄亥俄州立大學(xué)詹姆斯綜合癌癥中心癌癥代謝中心、俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)和藥理學(xué)系腫瘤微生物在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療過程中起著重要作用，且極有可能成為腫瘤早期診斷和治療的標(biāo)志物，但同時也存在一定的挑戰(zhàn)，如腫瘤內(nèi)微生物含量低和不可培養(yǎng)，因此亟需新的高分辨率的技術(shù)來支持后續(xù)的研究。多組學(xué)技術(shù)（基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)）能從不同層次闡述腫瘤微生物，將對未來微生物與腫瘤微環(huán)境相互作用的研究產(chǎn)生巨大影響。本文系統(tǒng)總結(jié)了多組學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展及其在腫瘤微生物組研究中的應(yīng)用，為研究者提供了一個可供參考的組學(xué)工具箱。

1.引言
腫瘤微環(huán)境(Tumor Microenvironment, TME)中存在微生物并受其影響，目前地球上大約有1012種已知的微生物，只有11種被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)確認(rèn)為“腫瘤微生物”。研究人員發(fā)現(xiàn)微生物活體存在于多種腫瘤中（乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、皮膚癌、腎細(xì)胞癌，胃癌、肺癌、前列腺癌和鼻咽癌等；圖1），而且不同類型腫瘤中的微生物有驚人的相似之處。腫瘤內(nèi)微生物通過DNA損傷、致癌激活途徑、抗腫瘤藥物分解代謝和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等多種機(jī)制影響腫瘤的發(fā)展和治療（如：大腸桿菌釋放能夠誘導(dǎo)致癌DNA突變的基因毒素；幽門螺桿菌通過誘導(dǎo)炎癥和影響調(diào)節(jié)粘膜細(xì)胞生長和增殖的關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)信號通路；用于治療胰腺導(dǎo)管腺癌的化療藥物吉西他濱被腫瘤內(nèi)細(xì)菌代謝至失活狀態(tài)，從而導(dǎo)致耐藥性）。
 

圖1. 微生物的致癌作用以及多組學(xué)方法研究腫瘤微生物

2.用于腫瘤微生物組研究的基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)
基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)專注于研究參與基因表達(dá)調(diào)控的核酸（DNA和RNA）。目前，使用最廣泛的測序技術(shù)（圖2）包括三種二代測序系統(tǒng)（即Illumina、Ion Torrent、BGI）和兩種三代測序技術(shù)（即PacBio和納米孔）。這些測序方法（DNA測序，RNA測序，16S rRNA測序，表觀遺傳學(xué)測序（如ChIP-seq和DNA/RNA甲基化測序）和三維基因組技術(shù)）是發(fā)展各種基因組和轉(zhuǎn)錄組研究方法的基礎(chǔ)。此外，基因編輯工具的最新研究進(jìn)展已經(jīng)能夠在全基因組水平上進(jìn)行多基因操作。
 

圖2. 用于腫瘤微環(huán)境研究的基因組和轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)

2.1 DNA測序
DNA-seq通常用于三種類型的基因組分析：全基因組測序(Whole Genome Sequencing, WGS)、全外顯子測序(whole exome sequencing, WES)和靶向測序。隨著DNA技術(shù)的快速發(fā)展，DNA-seq正成為研究不可培養(yǎng)微生物（包括人類微生物組中的微生物）的有力工具�；�因組文庫的測序和異源表達(dá)極大地促進(jìn)了我們對代謝途徑和腫瘤微生物生理的理解。

2.2 16S rRNA測序
16S rRNA測序是一種專門針對細(xì)菌和古細(xì)菌表達(dá)的30S核糖體亞單位16S的測序技術(shù)；該序列包含交替的高度保守和高變區(qū)；保守區(qū)可用于設(shè)計(jì)擴(kuò)增靶向片段的通用引物，而高變區(qū)的分析可用于鑒定特定的細(xì)菌物種，盡管一些注釋可能低于物種水平。在腫瘤微生物組領(lǐng)域，16S rRNA測序主要用于研究群落中物種的組成、物種間的進(jìn)化關(guān)系以及微生物群落多樣性。

2.3 RNA測序（RNA-seq）
RNA-seq是一種轉(zhuǎn)錄組測序方法，其中高通量測序方法用于研究復(fù)雜樣品中不同RNA的群體，包括信使RNA(messenger RNA, mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(trainsfer RNA, tRNA)、非編碼RNA(noncoding RNA, ncRNA)和微小MicroRNA(micro RNA, miRNA)等。在過去幾十年里，RNA-seq技術(shù)已成為在轉(zhuǎn)錄組水平上分析基因表達(dá)不可或缺的工具。在RNA生物學(xué)領(lǐng)域，RNA-seq已廣泛應(yīng)用于研究單細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)和RNA結(jié)構(gòu)。RNA-seq技術(shù)的進(jìn)步也進(jìn)一步促進(jìn)了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展；直接長閱讀或全長RNA-seq方法、以及不斷更新的數(shù)據(jù)分析方法，使研究人員能夠更好地了解RNA生物學(xué)（包括轉(zhuǎn)錄過程機(jī)制以及折疊和分子間相互作用對RNA功能的影響）�？偟膩碚f，RNA-seq是通過基因轉(zhuǎn)錄水平上的分析來研究癌細(xì)胞和腫瘤微生物組通路交互影響的強(qiáng)有力工具。

2.4 表觀遺傳學(xué)技術(shù)
表觀遺傳學(xué)研究不涉及DNA序列改變的表型變化。與遺傳調(diào)節(jié)不同，典型的表觀遺傳變化（包括DNA/RNA修飾和組蛋白翻譯后修飾）是可逆的，且不影響細(xì)胞基因組序列。在真核細(xì)胞中，核小體作為染色質(zhì)組織的基本重復(fù)單位，主要由圍繞核心組蛋白八聚體纏繞1.5次的147個堿基對組成（如兩拷貝H2A、H2B、H3和H4）。DNA、RNA和組蛋白的共修飾是調(diào)控特定基因激活和抑制的關(guān)鍵機(jī)制。表觀遺傳調(diào)控在研究與人類疾病特別是癌癥密切相關(guān)的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和損傷修復(fù)過程中起重要的調(diào)控作用。

DNA甲基化在不改變基因序列的情況下調(diào)控轉(zhuǎn)錄，而腫瘤抑制相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)閉會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。大量研究表明DNA異常甲基化與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因而DNA甲基化水平的改變常被檢測為腫瘤診斷的標(biāo)志。目前，已經(jīng)開發(fā)了多種DNA甲基化測序技術(shù)，如全基因組亞硫酸氫鹽測序(Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS)，簡化的亞硫酸氫鹽測序(Reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)，氧化亞硫酸氫鹽測序(oxBS-seq)和無細(xì)胞甲基化DNA免疫沉淀和高通量測序(cfMeDIP-seq)。

組蛋白翻譯后修飾(Post-translational Modifications, PTMs)包括甲基化、磷酸化、乙�；�、巴豆酰化、泛素化、糖基化、糖化和ADP核糖基化，不同組蛋白PTMs被認(rèn)為與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如微生物的甲基乙二醛合酶(methylglyoxal synthases, MGSs)可以促進(jìn)TME中甲基乙二醛的生成；組蛋白MGO(methylglyoxal)-糖基化被發(fā)現(xiàn)通過影響染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)影響腫瘤的發(fā)展。

此外，染色質(zhì)免疫沉淀測序(Chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq)是基因轉(zhuǎn)錄水平組蛋白修飾的最常用方法之一，該技術(shù)起初主要用于研究蛋白和DNA的相互作用。ChIP技術(shù)主要用于研究胞內(nèi)相互作用和對研究基因水平的表觀遺傳學(xué)改變；ChIP-seq結(jié)合了ChIP和二代DNA測序技術(shù)，可以有效地檢測特定組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合位點(diǎn)。ChIP-seq的原理為：DNA片段純化與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合并通過ChIP純化富集和免疫共沉淀，然后純化并構(gòu)建文庫，富集的DNA片段通過高通量技術(shù)進(jìn)行測序；借助該技術(shù)，研究人員已經(jīng)精確定位了基因組中與特定組蛋白相互作用的序列和轉(zhuǎn)錄因子。對于腫瘤微生物組研究而言，ChIP-seq技術(shù)適用于宿主和微生物細(xì)胞的基因組或表觀遺傳學(xué)研究。

2.5 三維基因組學(xué)
三維基因組學(xué)亦即空間基因組學(xué)，主要基于一維（1D）基因組序列的基本信息，研究基因組的三維結(jié)構(gòu)和不同元件（包括轉(zhuǎn)錄因子和DNA/RNA結(jié)合蛋白）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。近年來，在該領(lǐng)域發(fā)展的技術(shù)主要包括高通量/高分辨率染色體構(gòu)象捕獲(high‐throughput/resolution chromosome conformation capture, Hi-C)，基于微球菌核酸酶的染色體折疊分析(micrococcal nuclease‐based analysis of chromosome folding, Micro-C)，使用長x-接頭的基于微球菌核酸酶的染色體折疊分析(micrococcal nuclease‐based analysis of chromosome folding using long x‐linkers, Micro-C XL)，通過成對末端標(biāo)簽測序的染色質(zhì)相互作用分析(chromatin interaction analysis by paired‐end tag sequencing, ChIA-PET)和HiChIP(in situ Hi‐C followed by chromatin immunoprecipitation)。

與腫瘤微生物組相關(guān)的研究主要集中于宿主細(xì)胞的真核基因組，最近Hi-C技術(shù)開始用于細(xì)菌染色體的研究，為生物樣本DNA序列的物理鄰近性提供依據(jù)。

2.6 基因組編輯
基因編輯也稱為遺傳修飾或基因工程，主要用生物化學(xué)的方法改變基因組序列，主要通過在基因組中插入目標(biāo)片段或刪除特定片段來實(shí)現(xiàn)�；�因編輯歷史悠久，常見工具包括轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(transcription activator‐like effector nucleases，TALENs)、成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)和CRISPR‐associated protein 9(Cas9)等。目前，CRISPR-Cas9技術(shù)及其衍生的技術(shù)是基因組編輯的主流技術(shù)。

腫瘤微生物組研究領(lǐng)域，基因編輯技術(shù)已廣泛用于宿主和微生物，發(fā)現(xiàn)腸道微生物的基因組組成變化很大。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示了全球宏基因組樣本中顯著的種內(nèi)遺傳變異。因?yàn)槲覀兛梢钥闯鯟RISPR‐Cas9技術(shù)在菌群研究領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。

2.7 單細(xì)胞基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)
基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法能提高覆蓋率同時降低假陽性，但組裝正確率取決于測序深度和群落復(fù)雜性，如宏基因組技術(shù)能研究復(fù)雜群體的細(xì)菌組成，但低豐度菌的序列可能被高豐度生物的序列掩蓋。此外，具有相似表型的細(xì)胞中的遺傳信息可能存在顯著差異，且低豐度信息可能會丟失。單細(xì)胞測序技術(shù)彌補(bǔ)這些局限性的同時，可以揭示單個細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)，同時能更好地反映細(xì)胞間的異質(zhì)性。

目前單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組主要基于4種研究方法：瓊脂平板稀釋、基于精細(xì)毛細(xì)管移液分離和倒置顯微鏡的單細(xì)胞外顯子組測序、基于液滴的微流體技術(shù)和改進(jìn)的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)法，而其中關(guān)鍵的一步是從組織或其他來源制備單細(xì)胞懸液。

2.7.1 瓊脂平板稀釋法
通過平板劃線獲得單一微生物的純培養(yǎng)物，然后反復(fù)稀釋微生物或不同細(xì)胞類型的混合物，從而將不同的群落分離成單細(xì)胞，這些單細(xì)胞將生長成同質(zhì)菌落（圖3A）。微流控劃線平板(microfluidic streak plate, MSP)技術(shù)基于微流控的傳統(tǒng)平板劃線技術(shù)。MSP使用微流體得到微液滴，在培養(yǎng)皿上劃線培養(yǎng)單細(xì)胞。傳統(tǒng)瓊脂平板稀釋和MSP都可以整合到高通量篩選工作流程中。

2.7.2 基于倒置顯微鏡和口吸毛細(xì)管移液系統(tǒng)方法
組織樣本的細(xì)胞懸浮液在倒置顯微鏡下用口吸毛細(xì)管系統(tǒng)或其他單細(xì)胞移液系統(tǒng)進(jìn)行處理得到單細(xì)胞。分離的單細(xì)胞經(jīng)確認(rèn)后隨機(jī)置于PCR管中，然后通過全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification, WGA)獲得基因組序列信息，同時可用于外顯子組測序（圖3A）。這種技術(shù)已被用于研究腎細(xì)胞癌和鄰近腎組織的研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生比以前認(rèn)為的更復(fù)雜，并促進(jìn)了更有效的細(xì)胞靶向治療的發(fā)展。由此我們也可以斷定，這種方法也可用于研究單個腫瘤細(xì)胞內(nèi)的微生物的研究。

2.7.3 微滴微流體法
該方法主要用于基于兩種不相容的液體來制備液滴，液滴的產(chǎn)生主要基于微管結(jié)構(gòu)和兩種液體之間的流速（圖3A），固定流速的泵驅(qū)動兩種液體進(jìn)入不同的微通道，當(dāng)它們相遇便產(chǎn)生微滴；這些液滴是理想的微反應(yīng)室，可容納單個細(xì)胞。單個液滴可通過系統(tǒng)進(jìn)行填充、操作、分離、組合、檢測和分類，從而得到數(shù)千個液滴。微滴微流體可以從大量細(xì)胞群中分離出單個細(xì)胞，通過一系列酶促步驟提取和分割基因組，遺傳物質(zhì)被擴(kuò)增和標(biāo)記后進(jìn)行單細(xì)胞測序。該技術(shù)結(jié)合了微流體技術(shù)、DNA條形碼和測序技術(shù)。

被包埋的微生物可以直接在液滴中培養(yǎng)，并在第一次擴(kuò)增過程中生長上百個細(xì)胞，然后裂解純化，用細(xì)胞分選儀將含有單細(xì)胞擴(kuò)增DNA的珠子分選到標(biāo)準(zhǔn)PCR板中，隨后再擴(kuò)增到單細(xì)胞擴(kuò)增基因組(single‐cell amplified genome, SAG)文庫中。基于SAG-gel平臺的典型單細(xì)胞測序方法（圖3A）的微流控液滴發(fā)生器已用于在瓊脂糖凝膠珠中培養(yǎng)小鼠腸道微生物。

包埋的單一微生物也可以直接裂解，然后進(jìn)行DNA擴(kuò)增或RNA逆轉(zhuǎn)錄和條形碼標(biāo)記。對于單細(xì)胞基因組測序，細(xì)胞通常首先被擴(kuò)增，然后進(jìn)行標(biāo)記；單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，通常首先標(biāo)記細(xì)胞RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄，最后是互補(bǔ)DNA(cDNA)擴(kuò)增（圖3A）。為了研究細(xì)胞內(nèi)的核小體，核小體必須首先用條形碼標(biāo)記，然后進(jìn)行免疫沉淀(single-cell ChIP-seq)和DNA擴(kuò)增（圖3A）。微滴微流體技術(shù)可以分析數(shù)百萬個獨(dú)立的反應(yīng)，目前該技術(shù)也被用于單個DNA分子的深度測序，通過單細(xì)胞芯片測序和高通量分析對被標(biāo)記的核小體進(jìn)行分析。

微滴微流控單細(xì)胞測序無需單獨(dú)培養(yǎng)微生物即可對細(xì)胞進(jìn)行測序。通過這種方法，可以得到宏基因組數(shù)據(jù)庫以研究腫瘤和其他區(qū)域（如腸道）中的微生物。這種方法的局限性在于，它從單拷貝基因組開始，但在酶和微流體處理過程中信息的損失不可避免，從而降低單個細(xì)胞信息的覆蓋率。

2.7.4 改進(jìn)的熒光原位雜交法
熒光原位雜交(FISH)是研究培養(yǎng)微生物的重要工具，可用于鑒定單細(xì)胞，也可用于標(biāo)記靶向RNA（圖3B）。RNA拷貝數(shù)可以反應(yīng)在熒光水平上，因此該技術(shù)尤其適用于靶向rRNA的檢測。16S rRNA不同區(qū)域的保守度不一樣，可以根據(jù)菌類型設(shè)計(jì)特異性的引物。

為解決分辨率低的問題，研究者們又開發(fā)了一些其他的方法，如催化報告分子沉積-熒光原位雜交(catalyzed reporter deposition‐FISH, CARD-FISH)使用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的探針以指數(shù)倍數(shù)放大信號，以便對單細(xì)胞進(jìn)行特異性的熒光標(biāo)記；Highly phylogenetic resolution FISH(HiPR‐FISH)技術(shù)在已有的單細(xì)胞自動圖像分割的基礎(chǔ)上執(zhí)行像素分類和圖像優(yōu)化濾波。這些技術(shù)的發(fā)展對特定的微生物種群、含量低微生物和極低拷貝數(shù)RNA的可視化和分類及實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞定量有重要作用。FISH可能會首先用于鑒別和定位腫瘤組織中的微生物。
 

圖3. 單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組方法

2.8 蛋白質(zhì)組學(xué)
基因和轉(zhuǎn)錄的表達(dá)和調(diào)控水平可直接反應(yīng)在成千上萬的蛋白質(zhì)的表達(dá)、PTMs和蛋白-蛋白間的相互作用水平上。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Mass spectrometry coupled with liquid chromatography, LC-MS)是蛋白質(zhì)研究中最常用的方法之一，且已成為腫瘤微生物組研究的有力工具。蛋白質(zhì)組學(xué)研究有三種不同的策略：top‐down，middle‐down 和bottom‐up；其中top‐down（圖4A）直接用MS對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，無需其他預(yù)處理；middle‐down首先將蛋白質(zhì)酶解成大的肽段，然后用質(zhì)譜進(jìn)行檢測；bottom‐up也稱為鳥槍法，是使用最廣的一種方法，蛋白質(zhì)酶解成含有6-20個氨基酸的肽段（圖4B）。

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要是篩選健康和疾病間的差異表達(dá)蛋白。目前基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)主要方法有數(shù)據(jù)依賴采集(data‐dependent acquisition，DDA)和數(shù)據(jù)非依賴性采集(data‐independent acquisition, DIA)（圖4B）2種。在串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）中，DDA只對部分母離子進(jìn)行二級掃描；而DIA對所有母離子的MS2信息進(jìn)行采集，因此DIA已成為臨床樣本（如腸道微生物樣本）機(jī)制和生物標(biāo)志物篩選研究中最受歡迎的數(shù)據(jù)采集方式，且DDA主要用于靶標(biāo)檢測。靶標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要通過PRM(parallel reaction monitoring)或MRM(multiple reaction monitoring)方式對樣本中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢測。蛋白定量包括相對定量和絕對定量，絕對定量首先通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣本中的蛋白進(jìn)行定量；相對定量無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過相對含量確定蛋白在2樣本中差異倍數(shù)。

相對定量中，又有標(biāo)記和非標(biāo)記2種方法；非標(biāo)記定量不需要同位素標(biāo)記蛋白就可對不同生物樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量；標(biāo)記定量主要有iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)，TMT(tandem mass tag)和SILAC(stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture)，主要用同位素標(biāo)簽標(biāo)記或者替換相應(yīng)氨基酸；TMT（圖4D）和iTRAQ主要用于體外標(biāo)記，而SILAC用于體內(nèi)標(biāo)記（圖4C）。標(biāo)記的方法可將不同來源的蛋白的含量通過一次實(shí)驗(yàn)檢測出來，且對低豐度蛋白和PTMs含量的改變有較好的靈敏度。
 

圖4. 蛋白質(zhì)組學(xué)的不同技術(shù)

2.9 代謝組學(xué)
代謝組學(xué)技術(shù)主要用于檢測生物體內(nèi)代謝物。代謝組學(xué)在腫瘤微生物組研究中致力于識別腫瘤微生物的代謝差異及其與周圍環(huán)境的相互作用，能加深對腫瘤微生物影響腫瘤機(jī)制的理解。與微生物相關(guān)的代謝物主要包括短鏈脂肪酸(short‐chain fatty acids，SCFAs)、氨基酸類代謝物 、維生素、膽汁酸(bile acids, BAs)、乳酸、毒素和甲酸鹽等。許多研究表明，微生物相關(guān)的代謝物可以正向或負(fù)向調(diào)控免疫、炎癥、信號通路或改變腫瘤微生物（圖5A），從而顯著影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

SCFAs是腸道菌群的主要代謝物之一，可以對腸道功能和腸道代謝產(chǎn)生正向或負(fù)向的影響；另外已有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充某些產(chǎn)生SCFA的菌可以抑制腸道腫瘤的發(fā)展；此外，SCFAs也有望成為結(jié)直腸癌的診療靶點(diǎn)。異戊酸(Isovaleric acid, IVA)是一種與結(jié)直腸癌相關(guān)的腸道微生物相關(guān)的SCFA，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致下游5-羥色胺（5-HT）的增加；5-HT可直接作用于腫瘤干細(xì)胞，促進(jìn)自我更新而增加腸道腫瘤發(fā)生。

微生物的其他代謝物也可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的代謝，如異石膽酸可以增強(qiáng)氧化磷酸化和線粒體ROS，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化；一些回流BA可增加促進(jìn)胃癌的發(fā)生的牛脫氧膽酸的產(chǎn)生。產(chǎn)毒素細(xì)菌艱難梭菌可激活腸上皮祖細(xì)胞中的信號通路，增加ROS產(chǎn)生和促進(jìn)腫瘤的黏膜免疫反應(yīng)；具核梭桿菌分泌的甲酸鹽可以激活增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲力相關(guān)的信號通路；來自腸道菌群的氧化三甲胺(Trimethylamine oxide, TMAO)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫；沒食子酸是腸道微生物的另一種代謝產(chǎn)物，也已被證明可以調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞并增強(qiáng)癌癥免疫治療。腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物可通過誘導(dǎo)突變、增強(qiáng)腫瘤相關(guān)促炎反應(yīng)、招募免疫抑制細(xì)胞等方式促瘤；腸道真菌還可以誘導(dǎo)促瘤炎癥微環(huán)境，并產(chǎn)生真菌毒素從而誘導(dǎo)突變，促進(jìn)腫瘤。
 

圖5. 用于腫瘤微生物組研究的代謝方法

2.9.1 腫瘤微生物相關(guān)代謝物分析和樣本預(yù)處理方法
代謝組學(xué)主要有NMR(nuclear magnetic resonance)和MS(mass spectroscopy)兩個平臺；NMR非破壞性的且不依賴于分離技術(shù)、樣品制備相對較快、操作簡便、成本低；向樣品中加入已知濃度的內(nèi)標(biāo)化合物可以提高NMR的絕對定量；由于NMR靈敏度相對較低、微生物代謝物的復(fù)雜性以及代謝物濃度范圍跨度大，從而限制了該平臺在微生物代謝組學(xué)中的應(yīng)用。

高分辨率MS成為代謝組學(xué)研究中的主流平臺。利用包括LC、氣相色譜(gas chromatography, GC)和毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)在內(nèi)的分離技術(shù)克服了NMR平臺存在的問題并廣泛用于微生物代謝組學(xué)。GC-MS由于性能穩(wěn)定且結(jié)果重現(xiàn)性好而廣泛用于代謝組學(xué)研究，但GC-MS主要用于揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性低分子量化合物的檢測，而大多數(shù)微生物代謝物（如磷酸化化合物）是非揮發(fā)性的和熱不穩(wěn)定的代謝物，因此，對于微生物來源的代謝物需要經(jīng)衍生化處理。

與GC-MS和LC-MS相比，CE-MS用于代謝組學(xué)研究有較好的分辨率、所需樣品量少且成本低，而CE和MS間的連接問題限制了其在代謝組學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。與其他技術(shù)平臺相比，LC-MS和LC-MS/MS可以不經(jīng)衍生化處理檢測極性和高分子量物質(zhì)，樣品制備方便；此外，LC-MS靈敏度高，所需樣品量少；此外，超高效液相色譜(ultrahigh performance liquid chromatography, UHPLC)的出現(xiàn)大大提高了LC-MS的色譜分辨率。

代謝組學(xué)主要分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)；非靶向代謝組學(xué)對樣本中的所有物質(zhì)進(jìn)行檢測，而靶向代謝組學(xué)是指基于SRM和標(biāo)準(zhǔn)曲線對目標(biāo)代謝物進(jìn)行相對或絕對定量，TQMS(triple quadrupole MS)和傳統(tǒng)的離子阱質(zhì)譜(ion trap mass spectrometers, iTRAQ)是靶向代謝組學(xué)研究的主要技術(shù)平臺。四極桿飛行時間(quadrupole time of flight, Q-TOF)質(zhì)譜儀、傅里葉變換離子回旋共振(Fourier‐transform ion cyclotron resonance, FT-ICR)質(zhì)譜儀和基于離子阱質(zhì)量分析器軌道阱的質(zhì)譜儀(Orbitrap)等高分辨率質(zhì)譜儀，因采集速度快而廣泛用于非靶向代謝組學(xué)研究。

鑒于胞內(nèi)代謝隨時間和外部環(huán)境快速變化，因此，取樣和樣品制備的方法和條件（如時間和儲存條件等其他因素）對代謝檢測的重現(xiàn)性、精密度和準(zhǔn)確度有較大的影響。樣品制備主要分為代謝淬滅和代謝物提取兩個過程，淬滅是在盡量不損傷細(xì)胞膜的情況下快速停止胞內(nèi)代謝；快速收集好的組織或細(xì)胞樣品可快速置于液氮中淬滅，然后-80℃保存；此外，冷凍淬火和化學(xué)淬火或用酸或冷甲醇水溶液淬滅也是常用的淬滅方法。

樣本中代謝物的提取可以通過物理方法，手工研磨或使用組織勻漿器實(shí)現(xiàn)，其中基于甲醇、氯仿和乙腈等的有機(jī)溶劑萃取由于提取效率高而常用于代謝物的提取，此外有機(jī)溶劑提取法對LC-MS的離子抑制效應(yīng)也更��；基于NMR的分析方法無需對樣本進(jìn)行處理，樣品制備簡單。LC-MS和NMR在微生物相關(guān)代謝物檢測分析方面各有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，研究人員可以根據(jù)感興趣化合物的特性和自身平臺的特點(diǎn)來選擇合適自己研究的方法。

2.10 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)
單細(xì)胞測序主要用于細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組的研究；同樣，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組和單細(xì)胞代謝組在單細(xì)胞水平的基因組和轉(zhuǎn)錄組水平的研究中也有重要作用，但單細(xì)胞蛋白和代謝物的信號不能被放大；追蹤是代謝組和蛋白組學(xué)研究中最大的挑戰(zhàn)，因?yàn)檫@對于減少樣品處理過程中細(xì)胞內(nèi)分析物的損失至關(guān)重要。

單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究之前由于缺少明確和普遍適用的方法而只處于起步階段；隨著MS靈敏度的提高和樣品制備方法的不斷改進(jìn)，單細(xì)胞蛋白和復(fù)合蛋白的絕對定量取得很大的進(jìn)展。

基于Orbitrap的高分辨質(zhì)譜在離子傳輸效率、檢測靈敏度和分辨率等方面得到了極大的改善，尤其是最新一代的Orbitrap Eclipse MS上分析單個HeLa細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，肽段和蛋白的覆蓋率分別增加了36%和20%；最新的質(zhì)譜儀器，如傳統(tǒng)遷移譜(drift tube‐based ion mobility spectrometry, DT-IMS)，捕獲離子淌度質(zhì)譜(trapped ion mobility spectrometry, TIMS)和高場非對稱波形離子遷移譜(high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry, FAIMS)，可以提高從多電核肽段選擇性分離過濾單電荷肽段的能力，在非靶向蛋白質(zhì)組中，單電荷肽段的濾除對于樣本中蛋白的定性和定量有一定影響。

目前的單細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)主要利用檢測可培養(yǎng)微生物的代謝物組成，不能直接用于多細(xì)胞生物研究微生物與細(xì)胞間的相互作用。質(zhì)譜成像(Mass spectrometry imaging, MSI)可以檢測組織中的代謝物和其他生物分子，在單細(xì)胞代謝領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。

基于MSI技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix‐assisted laser desorption/ionization, MALDI)質(zhì)譜也是目前最常用的單細(xì)胞代謝組研究的分析技術(shù)；樣品在進(jìn)入質(zhì)譜前與基質(zhì)混合并用脈沖激光照射。MALDI-MS測量組織切片或載玻片上樣本不同點(diǎn)的代謝物，從而創(chuàng)建代謝物的空間圖譜；使用MALDI可以獲得空間分辨率低于5μm的質(zhì)譜圖，這使得研究代謝物的分子分布更加可靠。與其他方法相比，MALDI-MS的樣本前處理簡單通量高，已用于單細(xì)胞生物體克隆群體中的異質(zhì)性和組織中特異的微生物和細(xì)胞亞型研究；但MALDI存在代謝物覆蓋率低和電離效率低的缺陷。為了克服MSLDI低覆蓋率的缺陷，有科學(xué)家提出了一種基于不同電離度的多種基質(zhì)的MSI方法，但該方法仍不能檢出低離子能的代謝物。開發(fā)的MALDI-2通過在第二個激光器產(chǎn)生的氣相激光羽流中啟動額外的電離增強(qiáng)分析物信號。

MSI技術(shù)的改進(jìn)對提高細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上不同代謝物產(chǎn)生了很大的影響，但MSI仍存在許多挑戰(zhàn)。MSI能獲得已知和未知代謝物的信號，軟件和數(shù)據(jù)庫的改進(jìn)大大提高代謝物鑒定準(zhǔn)確性。

2.11 應(yīng)用多組學(xué)方法進(jìn)行腫瘤微生物組研究
單一組學(xué)研究不足以全面理解與腫瘤微生物相關(guān)的更復(fù)雜的生物學(xué)過程，基于多種技術(shù)平臺的多組學(xué)技術(shù)成為強(qiáng)有力的研究工具。已有大量研究表明微生物產(chǎn)生的細(xì)胞毒性代謝物在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，如糖酵解有氧和無氧途徑的重要中間物質(zhì)丙酮醛(methylglyoxal, MGO)，也可以在甲基乙二醛合酶(methylglyoxal synthase)的作用下由微生物合成，MGO可以不通過酶解作用實(shí)現(xiàn)蛋白共價修飾，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的功能；此外，MGO可以通過與鳥嘌呤殘基反應(yīng)誘導(dǎo)DNA和RNA損傷，也能破壞有絲分裂期間破壞染色體分離直接影響基因組的完整性。

此外，MGO還可以與蛋白的賴氨酸殘基反應(yīng)形成糖基化產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)，進(jìn)而影響細(xì)胞功能并導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。MGO作為一種糖化試劑，可導(dǎo)致代謝紊亂、表觀遺傳的改變和核小體不穩(wěn)定；MGO還可以影響轉(zhuǎn)錄因子活性并改變基因轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞應(yīng)激因子的積累。組蛋白MGO糖基化的兩階段模型表明，低劑量的MGO可以通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄而利于癌細(xì)胞的增殖，但過量的MGO可導(dǎo)致染色質(zhì)交聯(lián)，弱化轉(zhuǎn)錄并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

通過化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究表明，高濃度MGO可通過誘導(dǎo)染色質(zhì)中的組蛋白-組蛋白和組蛋白-DNA交聯(lián)損傷其動力學(xué)特征；基于MGO糖基化的化學(xué)探針在MGO糖基化追蹤、富集等方面有較好的應(yīng)用前景，對潛在生化功能的理解也有一定的促進(jìn)作用。由此可知，MGO能在基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組水平上調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展（圖6），對MGO的研究也進(jìn)一步表明，單一組學(xué)不足以全面了解這些蛋白質(zhì)在生物學(xué)研究中的作用。
 

圖6. 多組學(xué)應(yīng)用促進(jìn)相互關(guān)聯(lián)學(xué)科的綜合研究

3.未來展望
腫瘤微生物在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療過程中起著重要的作用；微生物、腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用對腫瘤微環(huán)境有較大的影響。免疫細(xì)胞不僅影響微生物與抗癌療法，而且能直接調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展過程中的微生物。因此，微生物治療與免疫治療相結(jié)合有望成為癌癥治療有效方法。多組學(xué)技術(shù)已經(jīng)用于腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞和微生物標(biāo)志物研究，極大地促進(jìn)了新診斷和治療策略的發(fā)展。盡管組學(xué)技術(shù)在腫瘤領(lǐng)域取得了許多進(jìn)展，但該領(lǐng)域的研究仍處于起步階段，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)在腫瘤微生物研究中很大程度上仍然是理論性的；此外，腫瘤微生物組多組學(xué)研究缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)流程。

本文系統(tǒng)總結(jié)了腫瘤微生物組研究的多組學(xué)方法及個方法的優(yōu)缺點(diǎn)。盡管存在著腫瘤內(nèi)微生物含量低且TME異質(zhì)性高等問題，但單細(xì)胞多組學(xué)的發(fā)展必將克服這些難題，成為腫瘤微生物組研究中最有力的工具。