本文要點：基于稀土摻雜納米晶體(RENC)的短波紅外(SWIR，1000-3000 nm)熒光生物成像具有更深的穿透深度和更高的清晰度，然而，它們的降頻發(fā)射很少能在超過1600 nm外顯示足夠的亮度，特別是在NIR-IIc中。本文提出了一類銩(Tm)自敏化RENC熒光探針，它在1600-2100 nm(NIR-IIb/c)處顯示出明亮的降頻發(fā)光，可用于活體生物成像。惰性外殼涂層最大限度地減少了表面猝滅，并結合了強交叉弛豫，允許LiTmF4@LiYF4納米粒子通過吸收800 nm(大斯托克斯位移~1000 nm，絕對量子產率~14.16%)或1208 nm(NIR-IIin和NIR-IIout)的近紅外光子來發(fā)射強降頻發(fā)射。此外，摻雜Er3+進行能量俘獲，實現了四波長的近紅外輻射和明亮的NIR-IIb/c發(fā)射。我們的結果表明，基于Tm3+的NIR-IIb/c納米探針具有高信噪比和清晰度，為未來應用和轉化到不同領域提供了新機會。

 

---

短波紅外(SWIR，1000-3000 nm)，也被定義為第二近紅外區(qū)(NIR-II)，在生理研究和生物醫(yī)學應用中具有廣闊的應用前景。在這一區(qū)域，超過1500 nm的發(fā)射被認為是另一個具有更高空間分辨率和更深成像深度的成像窗口。值得注意的是，NIR-IIb(1600-1700 nm)、NIR-IIc(1700-2000 nm)和NIR-IId/NIR-III(2100-2300 nm)波段的長端顯示出低散射損失和接近于零的自發(fā)熒光，這進一步提高了空間分辨率、信號背景比(SBR)和成像穿透深度，以實現更好的生物成像清晰度。然而，迄今為止，發(fā)射超過1600 nm的NIR-IIb熒光/發(fā)光探針仍然非常有限，僅有報道尾部延伸至1600 nm的AIEgens和硫化鉛(PbS)/硫化鎘(CdS)量子點。這些關鍵波長區(qū)域需要更多的具有高效率、低細胞毒性、大斯托克斯位移和光穩(wěn)定性的清晰且更亮的探針。

 

稀土摻雜納米晶體(RENC)由于其近紅外激發(fā)帶、窄發(fā)射帶和上述其他所需的優(yōu)點，已成為理想的NIR-II成像納米探針，在多路傳感、時間門控檢測、成像引導治療和外科手術中具有巨大的潛力。據報道，有幾個離子在NIR-II區(qū)有發(fā)射，包括在1185 nm處的Ho3+，1060 nm，1310 nm處的Nd3+，1525 nm處的Er3+，以及1450 nm處的Tm3+(圖1a)。Tm3+是少數幾種表現出從紫外到中紅外區(qū)域的不同光譜轉換的RE3+離子之一。通常報道的Tm3+在近紅外-II區(qū)的斯托克斯或下移發(fā)光(DSL)位于1450 nm(3H4→3F4，弱躍遷)，顯示出低發(fā)光效率，并在該區(qū)域與水強吸收競爭(圖1a)。因此，這極大地限制了基于Tm的探針在NIR-II區(qū)域進行光學成像。然而Tm3+的3F4→3F6躍遷顯示出從1600到2100 nm的強烈發(fā)射波段，通過進一步將穿透深度增加到亞厘米水平并消除自發(fā)熒光，可以實現高對比度的深層組織成像(圖1a)。到目前為止，Tm3+(1600-2100 nm)的這種光譜特性主要用作塊狀激光玻璃的激光應用的增益材料，還沒有利用Tm3+的NIR-IIb/c區(qū)發(fā)射用于活體生物成像的報道。這可能是由于在制備明亮的Tm摻雜納米顆粒過程中存在嚴重的濃度猝滅和表面猝滅，以及不適當的敏化劑所致。

 

在這里，為了滿足NIR-IIb或NIR-IIc發(fā)射探針的要求，本文首次提出了用于活體生物成像的高摻雜Tm3+離子自敏化納米顆粒。在本研究的設計中，Tm3+離子同時作為敏化劑和激活劑來吸收800 nm(近紅外-I)或1208 nm(近紅外-II)的光子，由于這種輻射躍遷引起的強烈的交叉弛豫(CR)，它們產生了有效的1600-2100 nm斯托克斯發(fā)射(3F4→3H6)。此外，還合理地摻雜了能量陷阱離子，如Er3+和Dy3+，以介導Tm3+敏化的下移發(fā)射。這些明亮的Tm納米粒子使得非侵入性深層組織成像能夠在SWIR窗口中以更高的質量和清晰度研究生物相互作用。

 

研究內容：在生物成像應用之前，首先系統地研究和比較了惰性/未摻雜殼層對重度摻雜Tm3+納米顆粒發(fā)光的影響。補充圖1a和圖1c中的透射電子顯微鏡圖像表明，所得到的純LiTmF4核和Tm@Y核殼納米粒子(Tm-NPs)具有均勻的形貌，平均尺寸分別為~9.8 nm×13.7 nm和~19.3 nm×24.8 nm(寬度×高度)。粉末X射線衍射分析表明，它們的表面形貌為四方的(I41/a)空間群。Tm-NPs的衍射峰與四方LiYF4晶體的參考圖很好地對應，表明形成了純相納米晶體(圖1d)。Tm-NPs的HAADF STEM圖像和元素映射結果進一步證實了它們的核-殼結構，成分邊界清晰，產生了明亮的Tm3+核和深色的Y3+殼(圖1e)。

 

接著研究單一Tm摻雜的膠體納米晶體的發(fā)光性質。Tm-NPs在環(huán)己烷溶液中的下轉移發(fā)光（DSL）為1600~2100 nm，這歸因于3F4→3H6在800 nm光照射下的躍遷。由于Stark分裂的襯底具有3F4態(tài)，~1800 nm處的多波段發(fā)射光譜位于NIR-IIb/c區(qū)，適合NIR-II成像。然而，與干燥的TM-NPs的全光譜(圖1a)相比，作為溶劑的環(huán)己烷由于其自身的強NIR-IIc吸收而嚴重猝滅了1680-1900 nm附近的發(fā)光。

圖1

 

對于Tm3+的濃度介導的DSL，在納米材料(僅核心)中也發(fā)生了嚴重的濃度猝滅，但在LiYF4殼的外延生長之后，觀察到DSL強度的穩(wěn)定增加(圖2a)。電子填充過程可以解釋Tm-NPs的強濃度依賴性發(fā)光現象，如圖2c所示。Tm3+離子通過激發(fā)電子直接敏化吸收800 nm光子，并通過從3H4到3F4(1450 nm)，然后從3F4到3H6 (1600-2100 nm)的兩個連續(xù)輻射躍遷路徑填充3H4態(tài)。3H4與3F4能級和3F4到基態(tài)之間的能隙分別約為6850 cm−1和5890 cm−1。這兩個緊密的能隙使得3H4→3F4和3H6→3F4躍遷之間能產生高效的Tm3+→Tm3+ CR，這保證了更多被吸收的光子填充到中間3F4能級，然后躍遷到基態(tài)(3H6) 以增加NIR-II發(fā)射強度。盡管3F4→3H6躍遷的發(fā)光單調增加，但隨著Tm3+摻雜濃度從10%增加到40%，Tm-NPs的衰減時間逐漸減少，隨著Tm3+摻雜濃度從60增加到100%，在1680 nm處的發(fā)射壽命可能由于尺寸差異而增加(圖2b)。1450 nm發(fā)射壽命進一步證明了3H4和3F4能級種群競爭的濃度依賴性。隨著Tm3+濃度的增加，發(fā)光強度進一步減弱，因為逐漸增加的CR抑制了3H4態(tài)的自發(fā)發(fā)射，同時增加了3F4的數量。LiYF4的殼層厚度從~ 1.7、2.8 nm增加到5.0 nm，正如預期的那樣，在800 nm激發(fā)時，發(fā)射顯著增加(圖2d)，這表明外延惰性殼與耦合到表面的Tm3+激活劑分離。在1680 nm處發(fā)射的熒光壽命由0.2 ms和0.8 ms變化為5.2 ms，表明LiYF4殼體增厚降低了表面淬滅，在2.8 ~ 5.0 nm范圍內壽命對殼體厚度特別敏感。鑒于此，推測這一現象可以從兩個方面解釋:(1)惰性殼抑制了濃度和表面淬滅，以及(2)Tm3+濃度的增加增強了CR過程。

 

值得注意的是，摻雜高濃度的Tm3+使Tm-NPs在NIR-II區(qū)域(1208 nm, 3H5狀態(tài))激發(fā)，(800 nm處吸收截面為8.25 × 10−22 cm2, 1208 nm處吸收截面為1.5 × 10−21 cm2)。這些Tm-NPs在1208 nm的照射下產生的發(fā)射峰和分支比與在800 nm激發(fā)下看到的相同。隨著Tm3+離子濃度的增加或殼層厚度的變化，分別觀察到DSL發(fā)射增強，且趨勢相同(圖2e)，說明這些發(fā)射波段來自相同的躍遷過程。這是第一次報道在可分散的NPs中觀察到Tm3+在1600-2100 nm的發(fā)射，特別是在800 nm和1208 nm激發(fā)時。

 

接下來，選擇了與Tm3+能級匹配的摻雜離子（如Er3+和Dy3+）用于能量捕獲，旨在提供更明亮的NIR-II發(fā)射。首先在800 nm激發(fā)下研究了Er3+離子摻雜劑。其中，當摻雜Er3+時(<1%，0.2%為最佳，Tm(02Er)-NPs)，1680 nm處的下轉移發(fā)射得到了提高，摻雜更多的Er3+導致了下降趨勢(圖2f)。此外，研究3F4狀態(tài)下相應的時間分辨種群(圖2g)。通過Tm3+和Er3+之間的能量轉移，抑制Tm3+的CR，加速了3F4狀態(tài)的減少(圖2 h)。當Er3+摻雜濃度進一步增加到10%以上時，雖然在1600-2100 nm處的發(fā)射強度有所降低，但在近紅外區(qū)域，通過四波長照射，甚至可以激發(fā)得到Tm/Er“合金”NPs(如30%Er摻雜，Tm(30Er)-NPs)，并分別在980 nm和1530 nm激發(fā)時觀察到附加發(fā)射帶(圖2i，吸收截面:800 nm時9.5 × 10−22 cm2, 980 nm時1.075 × 10−21 cm2, 1208 nm時1.75 × 10−21 cm2, 1530 nm時2.12 × 10−21 cm2)。值得注意的是，由于4I13/2水平的Er3+種群的增加，也發(fā)生了1525 nm輻射(4I13/2→4I15/2)，如在980 nm激發(fā)下。此外，在800 nm激發(fā)(4 W/cm2)下，Tm-NPs的發(fā)光量子產率(1600-2050 nm)為~14.16%，Tm(02Er) NPs的發(fā)光量子產率為~16.13%。這些“合金”NPs為成像、防偽等涉及多波長選擇性激發(fā)調節(jié)的應用開辟了新的途徑。然而，摻雜Dy3+并沒有提高近紅外發(fā)射，在Tm3+晶格中摻雜少量Dy3+(0.2%)會被強烈淬滅，因為Dy3+具有密集的階梯狀能級。

 

圖2

 

基于Tm的NPs進行表面修飾，以提高其生物相容性

 

對于生物成像，選擇優(yōu)化的Tm(02Er)-NPs，并使用DSPE- PEG2000通過疏水-疏水相互作用進行修飾(圖3a)。聚乙二醇化后得到Tm(02Er)-NPs@PEG, TEM圖像如圖3b所示，無明顯聚集，動態(tài)光散射測定的水動力直徑為112±0.7 nm(圖3c)。監(jiān)測長期膠體穩(wěn)定性1個月。如圖3d所示，在這段時間內沒有發(fā)生明顯的尺寸變化，也沒有發(fā)生解離或沉淀，說明Tm探針在水溶液中分散良好且穩(wěn)定。由于O−H振動的非輻射失活(圖3e)， Tm探針在水溶液中的發(fā)光強度比在環(huán)己烷中下降得更多(9.4倍，在1680 nm處計算)。然而，1738 nm處的DSL強度與1680 nm發(fā)射處的DSL強度之比從0.37(環(huán)己烷)增加到0.76(水)，這是因為在該區(qū)域水的吸收比環(huán)己烷低(圖1a)。

 

值得注意的是，Tm3+的DSL可以從NIR-IIb到NIR-IIc。以發(fā)射在NIR-IIb區(qū)域(1525 nm)的基于Er的NPs為參考，量化NIR-IIc發(fā)射的優(yōu)勢。在800 nm激發(fā)下，在NIR-IIb和NIR-IIc下，記錄了相同濃度的基于Er-和Tm -NPs的相似發(fā)射強度(圖3e)，隨后使用HgCdTe (MCT)相機在不同的子窗口中成像(圖3f)。兩種探針分別在1524-1536 nm和>1700 nm范圍內可以清晰區(qū)分。此外，盡管兩者都可以在1500-1700nm的子窗口成像，但隨著長通濾波器從1500、1600到1700nm的變化，Er-NPs@PEG逐漸變得無法檢測到而明亮的基于Tm的探針仍然存在。這些結果表明，基于Tm的NPs可以作為NIR-IIb/c的優(yōu)秀候選。此外，在相同強度下，填充這些納米探針的毛細血管的發(fā)光圖像顯示，當SBR為1.35,FWHM = 0.55 mm的5 mm厚的1%脂內溶液覆蓋時，仍然可以觀察到基于Tm的NPs的發(fā)射，而Er-NPs@PEG的發(fā)射幾乎無法檢測到，這表明在NIR-IIb/c區(qū)域使用基于Tm的NPs具有相當大的穿透性和清晰度(圖3g, h)。此外，24小時CCK8檢測顯示，即使?jié)舛雀哌_800µg/mL, Tm納米探針的細胞毒性也很低(>90%存活率)。

圖3

 

體內成像研究

 

為了評估使用基于Tm的探針成像的可行性，并在NIR-IIb/c中實現理想的清晰度和深層組織穿透，首次在800 nm激發(fā)下使用MCT相機檢測超過1700 nm的發(fā)光來驗證小鼠的全身血管成像和血液循環(huán)。強烈的NIR-IIc信號使注射后2分鐘循環(huán)系統清晰可見。信號隨注射后時間的增加而減小。隨著時間推移，肝臟清晰可見(圖4a)，表明Tm-探針主要通過肝膽系統代謝。此外，由同一血管測定的NIR-IIc信號強度在血液中表現出中等的半衰期(49 min)，可以勾畫出病理狀態(tài)下的血管血流動力學。與超過1500 nm成像(FWHM = 78µm)相比，通過高斯擬合測量FWHM，確定NIR-IIc區(qū)域血管寬度為64µm(圖4b)，這表明NIR-IIc成像的空間分辨率提高了。這些結果證實了NIR-IIc區(qū)域的高分辨率成像性能。

 

此外，使用MCT和InGaAs (SD 640)攝像機進行血管成像，以確認基于Tm的探針在NIR-IIb區(qū)域的成像輪廓。結果表明，兩者的組織SBR相似(~2.2)。而在相同條件下，除了InGaAs相機采用高增益模式外，MCT相機的背景噪聲較低。這表明基于Tm的探針是優(yōu)秀的NIR-IIb成像探針，它也可以在InGaAs相機上成像良好。同時，Tm探針在1500 - 1600 nm之間具有微弱的發(fā)射，因此使用1500 nm LP在NIR-IIb窗口的探測主要從1600 nm開始。此外，用Tm探針處理的小鼠的組織學評估顯示，主要器官沒有明顯損傷。最后，采用Tm探針進行NIR-IIc成像，建立手術誘導的大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，以可視化血液循環(huán)系統功能障礙。成像結果顯示循環(huán)障礙，并且小鼠機體通過自我保護機制建立了側支循環(huán)。

 

此外，為了證明在1700-2100 nm范圍內檢測NIR-IIc成像的優(yōu)勢，將Tm(02Er)-NPs@PEG和Er-NPs@PEG探針(相同濃度)的混合物靜脈注射到小鼠體內，并用MCT相機在800 nm激發(fā)下成像。如圖4d, e所示，NIR-IIc成像的SBR(1.56)高于NIR-IIb成像(SBR = 1.27)。并且，與NIR-IIb相比，NIR-IIc窗口可以更清晰地觀察到微小的血管(包括Tm3+的部分發(fā)光)，這意味著比基于Er (NIR-IIb)的探針成像深度更深，清晰度更高。接著在口服灌胃小鼠兩種發(fā)光強度相同的探針的混合物后，進行胃腸道成像。灌胃1.5 h后，評價NIR-II在不同子窗口的成像性能。與Er納米探針的NIR-IIb成像(SBR = 5.4)相比，Tm基探針在NIR-IIc區(qū)域觀察到更高的SBR(8.6)(圖4f, g)。本文認為在1700-2100 nm子窗口的熒光/發(fā)光成像是一個重大突破，因為在1880 nm附近光吸收增加，光子散射最小化，組織自身熒光進一步被抑制。

 

繼續(xù)使用Tm(30Er)-NPs@PEG探針進行了體外和體內成像，以提供多波長激發(fā)特性的概念證明。使用1%的脂內溶液驗證Tm(30Er)NPs@PEG的NIR-IIc成像特性。在800 nm、980 nm和1208 nm激發(fā)下，可以觀察到類似的穿透深度和SBR。其中，在800 nm激發(fā)下，侵徹深度最深。但是，在1530 nm激發(fā)時，由于水的強烈吸收，導致滲透深度最低(3 mm厚度以內)。進行胃腸道成像。在灌胃30 min后記錄NIR-IIc的發(fā)光信號(1750-2250 nm)。SBR結果(圖4h)顯示，800,980和1208 nm激發(fā)提供了優(yōu)秀的NIR-IIc成像。但是在1530 nm激發(fā)時，由于水在1500 nm附近有強烈的吸收峰，無法獲得高質量的寬場成像。

 

最近有報道稱，在1540 nm或1650 nm激發(fā)下，NIR-IIc共聚焦顯微鏡可實現穿透深度為~500 μm的腹股溝淋巴結成像，其穿透深度是1200-1400 nm范圍內的兩倍。但是，需要更高的功率密度的1540nm的光。這些結果表明，如果通過增加激發(fā)功率或提高探針亮度來克服由于吸水引起的干擾，那么將激發(fā)和發(fā)射擴展到NIR-II可以提高成像性能。由此可見，這種多波長激發(fā)和發(fā)射系統(圖4i)為多通道成像/解耦治療提供了最佳選擇。

 

圖4

 

結論：本文成功開發(fā)了一種高效的基于Tm3+的NIR-II發(fā)光納米探針，其發(fā)射波長約為1800 nm，具有良好的生物相容性和良好的穩(wěn)定性。納米探針在800和1208 nm進行雙波長激發(fā)，表現出NIR-IIb到NIR-IIc發(fā)射(1600-2100 nm,3F4→3H6)。這種前所未有的光學特性將為體內高對比度深層組織成像提供替代方案。值得注意的是，本文的研究結果表明，Tm探針輔助NIR-IIc成像在穿透深度和清晰度方面明顯優(yōu)于NIR-IIb子窗口，這可能是由于受限的散射背景。重要的是，在這項工作中，濾波片和成像探針的發(fā)射特性共同決定了實際的成像窗口。要詳細地分析窗口的優(yōu)勢，未來的研究必須盡可能地保證特定窗口內的均勻發(fā)射和檢測。預計本項工作將促進NIR-IIc區(qū)域所需的、具有更高量子產率的探針的研究和開發(fā)。

 

參考文獻

Chang, Y.; Chen, H.; Xie, X.; Wan, Y.; Li, Q.; Wu, F.; Yang, R.; Wang, W.; Kong, X., Bright Tm(3+)-based downshifting luminescence nanoprobe operating around 1800 nm for NIR-IIb and c bioimaging. Nat Commun 2023, 14 (1), 1079.

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統 - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統 - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統，兼容成像型光譜儀

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評為“國家高新技術企業(yè)”，上海市“科技創(chuàng)新行動計劃”科學儀器領域立項單位。

          恒光智影，致力于為生物醫(yī)學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供先進的、一體化的成像解決方案。

          與基于可見光/近紅外一區(qū)的傳統熒光成像技術相比，我們的技術側重于近紅外二區(qū)范圍并整合CT, X-ray，超聲，光聲成像技術。

          可為腫瘤藥理、神經藥理、心血管藥理、大分子藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫(yī)藥與科學儀器服務。